蔬菜培养益生菌菌体动力学研究

吕嘉枥， 余 芳， 闫亚梅， 张军蒙， 田延楚

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)



蔬菜培养益生菌菌体动力学研究

吕嘉枥， 余 芳， 闫亚梅， 张军蒙， 田延楚

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

选用保加利亚乳杆菌为菌种，研究它在发酵复合蔬菜培养基过程中活菌数、pH值、溶氧量、亚硝酸盐、SOD酶的变化，探讨发酵过程中菌体生长的特性，再基于Logistic方程，建立了描述保加利亚乳杆菌菌体生长动力学模型.结果表明，在发酵温度为37 ℃，接种量为3%，装料量为70%，在发酵60 h时，活菌数可达9.3×109cfu/mL，SOD酶活力可达169.32 U/mL，亚硝酸盐含量可控制在0.12 mg/kg左右，而且保加利亚乳杆菌发酵动力学模型的理论数据与实验数据拟合良好，基本反映了保加利亚乳杆菌发酵过程的生长动力学特征.

保加利亚乳杆菌； 发酵； SOD酶； 亚硝酸盐； 动力学模型

0 引言

益生菌是对营养需求比较高的菌群，目前学者对益生菌的促生长作用研究较多，其中蔬菜作为益生菌增菌因子的研究显得非常活跃，而芹菜、平菇、鸡腿菇、黄豆芽、马铃薯、白菜、胡萝卜、西红柿、香菇、大葱、青瓜、卷心菜等蔬菜[1-6]研究的较多.康婕等[7]研究了48种常见蔬菜对保加利亚乳杆菌的增菌效果，结果表明，对保加利亚乳杆菌有显著促生长作用的蔬菜其菌体浓度在8.78×108～2.67×109cfu/mL.孟祥晨等[8]、李志成等[9]优化麦芽汁、番茄汁、真菌浸汁、胡萝卜汁等增殖因子的用量得到其最优培养基，在其最优培养基中活菌数可达5.46×109cfu/mL.李平兰等[10]研究了胡萝卜汁、牛奶和香菇浸提液对双歧杆菌体外促生长作用，结果表明3种食品原料对双歧杆菌均有促生长作用，其中香菇浸提物对双歧杆菌的体外促生长作用最大.张兰威等[11]研究了卷心菜、平菇、海带、胡萝卜等作为增殖因子对双歧杆菌的增菌效果，结果表明，长双歧杆菌在最优培养基中的活菌数达到2.45×109cfu/mL；婴儿双歧杆菌在最优培养基中的菌数可达2.58×109cfu/mL.然而关于益生菌发酵蔬菜的动力学研究的较少.本课题研究了保加利亚乳杆菌在发酵复合蔬菜培养基的过程中活菌数、pH值、溶氧量、SOD酶和亚硝酸盐含量变化，并对保加利亚乳杆菌发酵蔬菜培养基的动力学进行了研究，建立了保加利亚乳杆菌菌体生长动力学模型，动力学模型的构建对于了解菌体的生长，实现发酵条件优化和发酵自动化控制具有重要的意义.

1 材料和方法

1.1 原材料和试剂

(1)原材料:黄瓜、白萝卜、薏苡仁、莲子、荸荠、甜瓜，由华润万家超市提供.

(2)菌种:保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus简称LB)，由陕西科技大学食品与生物工程学院微生物研究室提供.

(3)试剂:N-1-萘乙二胺盐酸盐(分析纯),天津市科密欧化学试剂有限公司；亚硝酸钠(分析纯),天津市红岩化学试剂厂；冰醋酸(分析纯),西安三浦精细化工厂；超氧化物歧化酶(SOD酶)试剂盒,南京建成科技有限公司.

1.2 仪器与设备

B203LEDR生物显微镜,重庆奥特光学仪器有限公司；AC-0629普通光学显微镜,重庆光学仪器有限公司；DHP9080电热恒温培养箱,上海佳胜实验设备有限公司；LS-C50L型立式压力蒸汽灭菌锅,江阴滨江医疗设备厂；UV-2600紫外分光光度计,龙尼柯上海仪器有限公司；HHW21-600电热恒温水箱,天津市泰斯特仪器有限公司;KRH-DPJ-7L发酵系统,江苏科海生物工程设备有限公司.

1.3 培养基

蔬菜培养基：黄瓜150 g，白萝卜80 g，薏苡仁110 g，莲子130 g，荸荠110 g，甜瓜420 g，蒸馏水1 000 mL，用高速组织捣碎机打浆，过40目筛，115 ℃条件下灭菌15 min，冷却后备用.

1.4 实验方法

1.4.1 发酵条件研究

为了确定发酵罐发酵过程中的各项参数，对发酵温度、接种量、装料量设定不同水平进行实验.发酵温度设置梯度为35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃，接种量的设置梯度为1%、2%、3%、4%、5%，装料量的设置梯度为50%、60%、70%、80%、90%，在0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h发酵过程中测定其活菌数变化.

1.4.2 稳定性试验

在复合蔬菜基础培养基中接入保加利亚乳杆菌，依次转接入100 mL、200 mL、500 mL、1 000 mL的蓝口瓶中进行扩大试验.发酵温度为37 ℃，接种量为3%，装料量为70%，发酵48 h后测定活菌数.

1.4.3 菌体动力学模型的构建

依据前期实验发酵条件，选择最佳的温度、接种量和装料量.在上述的基础上使用7 L的发酵罐进行发酵，设置转速为100 rpm，然后将7 L发酵罐灭菌冷却后，再将蔬菜培养基到入7 L发酵罐中进行灭菌，待培养基冷却到37 ℃时接入菌种，每隔4 h取样测定活菌数、亚硝酸盐含量和SOD酶含量.仪器自动记录发酵过程中的pH和溶氧.再使用Origin8.0对数据进行拟合，建立了菌体生长动力学模型.

1.4.4 菌体动力学模型的拟合检验[12]

为了检验菌体动力学模型的误差，使用Origin 8.0将保加利亚乳杆菌发酵动力学模型的理论数据与实验数据进行对比.

1.5 测定方法

(1)活菌数测定方法：高层琼脂柱计数[13].

(2)SOD酶活力的测定方法：试剂盒(羟胺法).

(3)亚硝酸盐含量测定方法：盐酸萘乙二胺法[14].

2 结果与讨论

2.1 不同发酵温度对LB生长的影响

在复合蔬菜基础培养基中接入保加利亚乳杆菌，分别设置发酵温度为35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃，接种量为2%，装料量为70%，每隔8 h测定活菌数.由图1可知,随着发酵时间的延长，活菌数都有不同程度的增加，发酵温度为35 ℃、41 ℃、43 ℃时的活菌数明显低于发酵温度为37 ℃和 39 ℃时的活菌数，发酵温度为39 ℃的活菌数低于发酵温度为37 ℃时的活菌数，所以37 ℃为较佳的发酵温度.

图1 不同发酵温度对LB生长的影响

2.2 不同接种量对LB生长的影响

在复合蔬菜基础培养基中接入保加利亚乳杆菌，分别设置接种量为1%、2%、3%、4%、5%，发酵温度为37 ℃，装料量为70%，每隔8 h测定活菌数.由图2可知,随着发酵时间的延长，活菌数不断增加，当发酵48 h，接种量为3%、4%和5%时，三者的活菌数比较接近，因此选用3%的接种量进行发酵.

图2 不同接种量对LB生长的影响

2.3 不同装料量对LB生长的影响

在复合蔬菜基础培养基中接入保加利亚乳杆菌，分别设置装料量为50%、60%、70%、80%、90%，发酵温度为37 ℃，每隔8 h测定活菌数.由图3可知,装料量不同，其发酵过程中活菌数也不同，当装液量为70%和80%时，两者活菌数比较相近，因此选用70%的装料量进行发酵.

图3 不同装料量对LB生长的影响

2.4 稳定性试验

在复合蔬菜基础培养基中接入保加利亚乳杆菌，依次转接入100 mL、200 mL、500 mL、1 000 mL的蓝口瓶中进行扩大试验.发酵温度为37 ℃，接种量为3%，装料量为70%，发酵48 h后测定活菌数.由图4可知,在菌种的转接过程中，菌体对复合蔬菜培养基的适应性增加，通过显微镜观察发酵过程中的菌体形态及生长状况，确定在复合蔬菜培养基中培养LB的稳定性较好.

图4 扩大培养对LB生长的影响

2.5 菌体动力学模型的构建

在上述的基础上使用7 L的发酵罐进行发酵，设置转速为100 rpm，仪器自动记录发酵过程中的pH和溶氧.每隔4 h取样测定活菌数、亚硝酸盐含量和SOD酶含量.并使用Origin8.0对数据进行拟合，建立了菌体生长动力学模型.由图5可知,保加利亚乳杆菌(LB)的调整期比较长，发酵0～20 h，生长较为缓慢，细胞不分裂，对外界环境变化敏感，活菌数基本没有增加，pH值下降不明显，溶氧量急剧下降至15.38%.20～44 h为对数期，代谢旺盛，菌体快速繁殖，发酵44 h后活菌数达到9.36×109cfu/mL，pH值迅速下降至3.12，溶氧量下降速度减缓，最后降低至3.99，随后进入稳定期，菌体产量达到最高，细胞停止增殖，但仍然存活，生长曲线趋于平稳.培养到48 h时进入衰亡期，菌体开始自溶，繁殖能力降低，开始产生次级代谢产物.同时，pH值保持在3.12左右，溶氧量保持在2.99左右.发酵0 h时，培养基中的SOD酶含量为131.70 U/mL，随着时间的延长，SOD酶的活力缓慢增长，发酵28 h后SOD酶的活力达到169.73 U/mL，在继续发酵过程中SOD酶的活力趋于稳定，发酵终点SOD酶的活力169.32 U/mL，发酵0 h时，亚硝酸盐的含量为1.61 mg/kg，发酵24 h后亚硝酸盐含量为11.21 mg/kg，在继续发酵过程中亚硝酸盐含量迅速下降，发酵48 h后亚硝酸盐含量稳定在0.12 mg/kg左右.显微镜下观察发酵过程中的菌体形态，保加利亚乳杆菌生长过程中，菌体形态良好.

图5 LB的发酵曲线

菌体生长模型

由5图知：保加利亚乳杆菌的生长曲线为典型的S型曲线，因此，采用以下Logistic方程来描述保加利亚乳杆菌发酵过程中菌体的生长学[15]：

(1)

该方程可积分为：

(2)

对保加利亚乳杆菌的生长曲线进行非线性拟合，最终拟合结果如图6所示.

图6 LB生长拟合曲线

拟合后的相关系数R2=0.998 58.各参数的最佳拟合值、标准差如表1所示.

表1 Logistic模型参数

将各参数带入方程(2)，得到保加利亚乳杆菌的活菌数(X)随时间变化的函数为：

(3)

由图6可知，利用软件Origin8.0绘制的保加利亚乳杆菌菌体生长动力学非线性拟合曲线的相关系数R2= 0.998 58，拟合值与实验值能够较好的吻合，变化趋势一致，说明此模型能较好的预测保加利亚乳杆菌在发酵过程中的生长情况.

2.6 菌体动力学模型的拟合检验

为了检验该动力学模型的误差，使用Origin8.0将保加利亚乳杆菌发酵动力学模型的实验数据与理论数据进行对比.由表2可知，活菌数的实验值与理论值误差均小于10%，最大活菌数达到9.23×109cfu/mL.在发酵初期，实验值比理论值低，由于菌体生长较为缓慢，细胞不分裂，对外界环境变化敏感，略有差异便会造成误差值百分数偏大，发酵后期，出现理论值比实验值高，但整个发酵过程中误差值小于10%，说明此模型理论值和实验值能够比较好的拟合.因此，本研究构建的保加利亚乳杆菌菌体动力学模型能够很好地描述保加利亚乳杆菌发酵过程中的菌体生长变化规律.

表2 发酵过程中的活菌数变化

3 结论

本研究以Logistic方程为基础，建立了保加利亚乳杆菌发酵复合蔬菜培养基过程中菌体生长动力学模型.比较可知，所建模型与实验数据能够比较好的拟合，在一定程度上揭示了保加利亚乳杆菌发酵复合蔬菜培养基的菌体动力学特征，可用来判断发酵过程的优劣，制定发酵工艺参数，实现发酵罐发酵的优化控制，为大规模的发酵提供理论依据.而且在发酵过程中测定了SOD酶和亚硝酸盐含量的变化.结果表明，在发酵温度为37 ℃，接种量为3%，装料量为70%的条件下，活菌数可达9.3×109cfu/mL；SOD酶的活力为169.32 U/mL；亚硝酸盐含量稳定在0.12 mg/kg左右.

[1] 周小莉.乳酸菌在燕麦基质中生长特性研究[D].无锡：江南大学,2012.

[2] 张 功，瑞 君，峥 嵘.平菇浸汁促进嗜酸乳杆菌生长的研究[J].微生物学通报,2002,29(4):65-67.

[3] 王 芳,马俪珍.鸡腿菇浸提液对乳酸菌生长的作用[J].山西农业大学学报(自然科学版),2003,23(4):342-344.

[4] 孟祥晨,李艾黎,霍贵成.嗜酸乳杆菌增菌培养基的优化[J].食品工业科技,2002,23(6):25-27.

[5] 梁敏山.乳酸菌增殖培养及直投式酸奶发酵剂的研究[D].成都：西华大学,2010.

[6] 黄君红,成洁珊,陈青荷.乳酸菌生长最佳培养基的筛选[J].中国酿造，2001(2)：9-11.

[7] 康 婕,吕嘉枥,刘 洋.不同蔬菜对保加利亚乳杆菌生长的影响[J].食品工业科技,2013,34(11):156-159.

[8] 孟祥晨,王弧峰,霍贵成.青春双歧杆菌增菌培养基的优化[J].食品与发酵工业，2002,28(7):15-19.

[9] 李志成,张连斌,段旭昌,等.嗜酸乳杆菌生长促进物质研究[J].中国食品学报,2006，6(5):40-44.

[10] 李平兰,国 辉,郑海涛.几种食品原料对双歧杆菌体外促生长效果初探[J].中国乳品工业,2001,29(6):14-16.

[11] 韩 雪,张兰威.双歧杆菌增殖因子的筛选及培养基的优化[J].食品与生物技术学报,2005,24(4):69-72.

[12] Alves M,Gonçalves T,Quintas C.Microbial quality and yeast population dynamics in cracked green table olives′ fermentations[J].Food Control,2012,23(2):363-368.

[13] 马向前,周德庆.双歧杆菌和乳酸菌的一种简便快速计数法[J].微生物学报,1997,37(1):62-63.

[14] GB/T 5009.33-2010,食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定[S].

[15] Elibol M,Mavituna F.A kinetic model for actinorhodin production by streptomyces coelicolor A3(2)[J].Process Biochemstry,1999,34(6):625-631.

【责任编辑：蒋亚儒】

Research on probiotic bacteria dynamics of vegetable cultivation

LV Jia-li， YU Fang， YAN Ya-mei， ZHANG Jun-meng， TIAN Yan-chu

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021， China)

Research on the viable number,pH value, dissolved oxygen,nitrite content and the change of SOD enzyme in the process of composite fermented-vegetables medium,and discuss characteristics of bacteria growth whenLactobacillusbulgaricusis chose as the strain of the bacteria.Then establish theLactobacillusbulgaricusgrowth dynamics model on the basis of the Logistic equation.The result shows that the number of living bacterium can reach 9.3×109cfu/mL,SOD enzyme activity finally achieves 169.32 U/mL,and nitrite content can be controlled in 0.12 mg/kg in temperature 37 ℃,inoculation quantity 3%,charging volume 70% when fermented 60 h.The theoretical data ofLactobacillusbulgaricusfermented-kinetics model fits well with the experimental data,which basically reflects the kinetics characteristics in processing ofLactobacillusbulgaricusfermentation.

Lactobacillusbulgaricus; fermentation; SOD enzyme; nitrite; dynamic model

2016-08-23

陕西省科技厅科技统筹创新工程计划项目(2011KTCQ03-08)； 西安市科技计划项目(CXY1513(3))

吕嘉枥(1964-)，女，陕西三原人，教授，研究方向：应用微生物学

1000-5811(2016)06-0130-05

TS201.3

A