拉萨扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤细菌的分离与鉴定

卢许波，赵 阳，德吉央金，格桑卓玛，德 吉

（西藏大学理学院，西藏 拉萨 850000）

拉萨扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤细菌的分离与鉴定

卢许波，赵 阳，德吉央金，格桑卓玛，德 吉

（西藏大学理学院，西藏 拉萨 850000）

开展瑞香狼毒（Stellera chamaejasma）根际土壤微生物的研究，能够为遏制草原上瑞香狼毒的肆虐提供参考资料。釆用稀释倒平板法从瑞香狼毒根际土壤中分离、纯化细菌；采用经典分类和26S rDNA D1/D2区域序列分析相结合的技术，对纯化的菌株进行鉴定。结果显示，分离自拉萨河谷（扎叶巴沟）的瑞香狼毒土壤中的细菌55株，归属为鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas melonis）、Pseudomonas sp.、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、日本假单胞菌（Pseudomonas japonica）、芽孢杆菌（Bacillus sp.），其中又以鞘氨醇单胞菌为优势种；扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤细菌的种群结构间存在一定差异。其中鞘氨醇单胞菌对瑞香狼毒的抑制作用值得进一步研究。

拉萨；扎叶巴沟；瑞香狼毒；土壤；26S rDNA D1/D2区域序列分析

目前，国内外对瑞香狼毒的研究有很多，涉及对花粉萌发和种子结实的花粉化感效应及其防控［6-7］，以及其地域分布、中药的性能等的研究［8］。研究方向倾向于对瑞香狼毒活性物质的提取以及测定活性物质对真菌、肿瘤细胞的抑制作用或体外抗氧化作用、免疫功效等［9-13］，如杨国红等对瑞香狼毒生物活性成分研究；王敏等对瑞香狼毒总黄酮的抗瘤研究；王宇等的瑞香狼毒总黄酮对老鼠的高脂血症降脂的研究等。

青藏高原被誉为第三极，独特的地理环境（高海拔、高寒、缺氧、强辐射等）造就了许多具有特异性的物种，加之地广人稀没有过多的人类活动，青藏高原的原始生态并未遭到太大破坏，可以说青藏高原是未完全开发的研究极端环境生物的基地。由于青藏高原地理环境的特殊性，也造就了丰富特殊的微生物资源［14］。而关于青藏高原的瑞香狼毒根际土壤的微生物尚未见报道。本研究旨在开展拉萨河谷瑞香狼毒土壤细菌多样性研究，以期为青藏高原微生物资源的开发利用以及为瑞香狼毒微生物抑制剂的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2015年9月，在拉萨河谷扎叶巴沟随机采取瑞香狼毒根际土壤9份。土壤样品为瑞香狼毒根际周围10 cm以内、土层垂直深度5～15 cm的土壤。牛肉膏蛋白胨培养基具体配制参照文献［15］进行。

1.2 细菌的分离纯化与鉴定

将土壤样品混匀，从每份土壤中称量1 g后迅速倒入含有99 mL无菌水的三角瓶中，震荡20 min，得到10-2土壤悬液。取10-2土壤悬液直至稀释至10-7土壤悬液。用移液器接种0.1 mL的10土壤悬液至牛肉膏蛋白胨培养基上，均匀涂抹，每份土壤样品处理3次重复，采用平板划线法进行菌株纯化，28℃培养2 d。样本由北京博迈德基因技术有限公司进行细菌鉴定。

1.3 数据处理

采用 Excel软件计算细菌多样性指数，计算不同土壤样品细菌Jaccard相似性系数，不同土壤中细菌总丰度差异性分析采用Duncan检验法。

细菌多样性指数主要包括物种丰富度、细菌总丰度、出现频率、相对丰度、Shannon-Wiener多样性指数（H′）、Pielou 均匀度指数（J′）及Simpson多样性指数（D）等。其中，物种丰富度指从其中某一份土壤样品分离的细菌物种数，细菌总丰度指某一份土壤样品分离的细菌数量（CFU/g），出现频率为某一种细菌出现的土壤样品数占所有土壤样品数的百分比，相对丰度指某一种细菌株数占所有细菌菌株数的百分比。

式中，N为某一份土壤分离细菌的总株数，Pi为某一份土壤第i种细菌菌株数与该土壤细菌总株数的比值。

2 结果与分析

2.1 拉萨河谷扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤细菌群落组成

结合经典分类法及种属鉴定将分离自拉萨河谷扎叶巴沟9份根际土壤的55株细菌归为3个属5个种。结果（表1）显示，鞘氨醇单胞菌属（1个属1个种）占分离菌株的29.09%，假单胞菌属（1个属2个种）占分离菌株的36.36%，芽孢杆菌属（1个属2个种）占分离菌株的34.55%。可见，9份土壤样品中这3个属的细菌相对丰度较高，没有显著差异。

从5种细菌在土壤中的分布情况（表1）可以看出，鞘氨醇单胞菌出现频率最高、为88.89%，其次为Pseudomonas sp.（77.78%）、蜡状芽孢杆菌（66.67%） 、芽孢杆菌（55.56%）。相对而言，日本假单胞菌分布不太广泛，只在4份土壤中出现。

表1 拉萨河谷扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤细菌种群分布

细菌种类水平相对丰度数据（表1）显示，鞘氨醇单胞菌相对丰度最高，占分离菌株数的29.09%；其次为Pseudomonas sp.（20.00%）和蜡状芽孢杆菌（20.00%），相对丰度也较高；日本假单胞菌和Bacillus sp.的相对丰度分别为16.36% 和14.55%。细菌出现频率和总相对丰度数据表明，鞘氨醇单胞菌为拉萨扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤中的细菌优势种。

2.2 拉萨河谷扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤样宽频细菌组成相似度分析

从表2可以看出，9份土壤细菌Jaccard相似性系数介于0～1之间。1号样品与3号、5号、6号、8号样品之间为极度相似（0.75～1），3号 样品与5号、6号、8号样品之间，5号样品与6号、8号样品之间以及6号样品与8号样品之间也呈极度相似（0.75～1）。而2号样品与其他8个样品之间相似度均较低，基本为极度不相似（0～0.25）。总之，不同样品间细菌组成存在不同程度的差异。

表2 拉萨河谷扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤样品细菌Jaccard相似性系数

2.3 拉萨河谷扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤细菌多样性指数分析

从表3可以看出，1号和6号土壤样品细菌物种丰富度最高，从其中均分离到5种细菌，其次是3号、5号和8号样品（4种），再次是4号样品（3种），而2号土壤 样品仅分离到1种细菌。9个样品的数量总丰富度并无显著差异。

采用Excel软件分析9份土壤样品细菌多样性指数，结果（表3）显示，1号和6号样品细菌多样性最丰富，分布也相对均匀，它们的H′和D约为1.47和0.75；3号、5号和8号样品细菌多样性也较丰富，而2号样品细菌多样性指数最低。

3 结论与讨论

采用稀释涂平板法从拉萨扎叶巴沟采取9份瑞香狼毒根际土壤获得55株细菌，经北京博迈德基因技术有限公司进行种属鉴定，将其归为3个属5个种。其中鞘氨醇单胞菌属相对丰度约为29%，在大多土壤样本中均有分布，为扎叶巴沟瑞香狼毒土壤根际的优势细菌种类。超过50%的土壤样品细菌多样性较为丰富，只有2个样品细菌种类极少分布不均匀。

表3 拉萨河谷扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤细菌多样性指数

代平等［16］研究显示，西藏土壤微生物结构在海拔3 100～3 800 m之间的细菌主要有大肠杆菌、绿脓杆菌、粪链球菌、嗜麦芽假单胞菌、枯草杆菌、聚团肠杆菌、产气荚膜梭菌、海洋梭菌、坏名梭菌等，这与本研究结果明显不同。另外，周攀［17］研究了青海瑞香狼队根际土壤细菌种类，发现根际细菌主要包括变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（B a c t e r o i d e t e s）、绿弯菌门（Chloroflexi）、抚微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（P l a n c t o m y c e t e s）、 芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）。这与本研究结果差别较大，一方面可能由于西藏高原土壤理化性质的差别导致细菌种群的差异，另一方面也可能与瑞香狼毒自身抑菌活性的差异有关，我们将进一步研究瑞香狼毒对不同种类微生物的皿内抑菌作用以及特殊微生物制剂对瑞香狼毒的活体防效等。这能为拉萨甚至青藏高原不同生境的瑞香狼毒土壤中的细菌多样性或资源的保护利用奠定基础。

蜡状芽孢杆菌广泛分布于自然界中，是食品及化妆品中常见的污染菌［18］，目前有学者开展了其对包内外酶（如胆固醇氧化酶）、除草活性、重金属离子（如Cr6+、Pb2+）污染处理活性等的研究［19-22］。芽孢杆菌属广泛分布于自然界中，目前有学者开展了其对废水染料、钾长石风化等的研究［23-24］。Pseudomonas sp.目前有学者开展了其对抗生素、污水处理、原料乳中携带菌的研究［25-27］。日本假单胞菌目前有学者开展了其对抗细菌活性的研究［28］。鞘氨醇单胞菌目前有学者开展了其对涉及污水处理的研究［29］。可见，拉萨河谷扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤分离出的细菌基本与降解环境中存在的污染物等有关，其中蜡状芽孢杆菌也与除草活性有关。

瑞香狼毒本身具有毒性，是肆虐草原的危害植物，拉萨河谷扎叶巴沟的瑞香狼毒根际土壤细菌多数具有降解污染物的潜力。比较西藏拉萨土壤的细菌群落组成可知，本研究所分离的菌种与西藏拉萨河谷的菌种差异极大，这可能与瑞香狼毒根部分泌的毒性物质有关。我们将进一步对获得的细菌菌株进行污染物降解能力的测定，以更好地开发利用青藏高原宝贵的微生物资源。

［1］ 史志诚，李柞煌，邹康南，等. 中国草地重要有毒植物［M］. 北京：农业出版社，1997：140-150.

［2］ 中国科学院青藏高原综合科学考察队. 西藏植物志［M］. 北京：科学出版社，1983：329-330.

［3］ 李亚伟. 藏北高寒草原狼毒资源的综合利用

［D］. 北京：中央民族大学，2013.

［4］ 王欢，马青成，耿朋帅，等. 天然草地瑞香狼毒研究进展［J］. 动物医学进展，2015，36（12）：154-160.

［5］ 金辉，杨晓燕，燕志强，等. 瑞香狼毒根际和土壤可培养细菌群落动态变化规律研究// 中国第六届植物化感作用学术研讨会论文摘要集［C］. 成都：中国植物保护学会植物化感作用专业委员会，2013.

［6］ 孙庚，罗鹏，吴宁. 瑞香狼毒对青藏高原东部高寒草甸主要物种花粉萌发和种子结实的花粉化感效应［J］. 生态学报，2010，30（16）：4369-4375.

［7］ 王庆海，李琴，庞卓，等. 中国草地主要有毒植物及其防控技术［J］. 草地学报，2013，21（5）：831-841.

［8］ 窦洪举，李锋，侯勇跃. 狼毒及瑞香狼毒的研究进展［J］. 畜牧与饲料科学，2013，34（11）：43-47.

［9］ 杨国红. 瑞香狼毒等三种药用植物的生物活性成分［D］. 上海：复旦大学，2005.

［10］ 王敏，贾正平，马骏. 瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用［J］. 中国中药杂志，2005，30（8）：603-605.

［11］ 王宇. 瑞香狼毒总黄爾对实验性高脂血症大鼠降脂作用的研究［D］. 呼和浩特：内蒙古农业大学，2015.

［12］ 窦洪举，李锋，侯勇跃. 狼毒及瑞香狼毒的研究进展［J］. 畜牧与饲料科学，2013，34（11）：43-47.

［13］ 赵磊，杜娟，卜春亚，等. 瑞香狼毒活性物质对草莓灰霉病菌的抑制作用［J］. 植物病理学报，2012，42（4）：411-417.

［14］ 孔维栋. 极地陆域微生物多样性研究进展生物多样性［J］. 生物多样性，2013，21（4）：456-467.

［15］ 黄秀梨，幸明秀. 微生物学实验指导［M］. 第2版. 北京：高等教育出版社，2015：附录二.

［16］ 代平，车应龙，曾桂茹，等. 西藏高原不同海拔高度土壤细菌学调查［J］. 中华预防医学杂志，1997（3）：188-89.

［17］ 周攀. 瑞香狼毒对根际微生物群落的影响及在干旱胁迫下狼毒蛋白表达谱的变化［D］. 西安：西北大学，2015.

［18］ 周帼萍，袁志明. 蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）污染及其对食品安全的影响［J］. 食品科学，2007，28（3）：357-360.

［19］ 葛飞，龚倩，张慧敏，等. Bacillus cereus SG03 10L发酵罐中产胞外胆固醇氧化酶发酵条件优化［J］. 食品工艺科技，2014，35（17）：137-140.

［20］ 杨娟，张明月，张崎峰，等. 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）XG1的分离、鉴定与除草活性研究［J］. 河北农业大学学报，2016，39（2）：81-86.

［21］ 肖伟，王磊，李倬锴，等. 六价铬还原细菌Bacillus cereus S5. 4还原机理及酶学性质研究［J］. 环境科学，2008，29（3）：751-755.

［22］ 潘建华，刘瑞霞. 蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus吸附铅的研究［J］. 环境科学，2004，25（2）：166-169.

［23］ 李凡姝，刘海洋，范丽莉，等. 菌株Bacillus sp. CLb芽孢漆酶对染料、模拟染料废水脱色的研究［J］. 安徽农业科学，2014，42（15）：4569-4572.

［24］ 黄智，何琳燕，盛下放，等. 矿物分解细菌Bacillus sp．L11对钾长石的风化作用［J］. 微生物学报，2013，53（11）：1172-1178.

［25］ 梁艳琼，贺春萍，郑肖兰，等. 解磷细菌对7种常见抗生素的抗性研究［J］. 中国农学通报，2013，29（33）：207-213.

［26］ 吕晶华，马挺，郑先强，等. PCR-DGGE技术解析A2/O工艺好氧单元中微生物群落结构［J］.环境工程学报，2012，6（6）：1904-1914.

［27］ 周国君，唐玲，胡萍，等. 应用PCR-DGGE对巴氏消毒乳中腐败细菌的污染溯源研究［J］. 食品工业科学，2015，36（16）：49-51，57.

［28］ 刘邮洲，Shien Lu，陈志谊，等. secG在假单胞菌Pseudomonas japonica YL23抗细菌活性中的功能研究//中国植物保护学会成立50周年庆祝大会暨2012年学术年会论文集［C］. 北京：中国植物保护学会，2012.

［29］ 吴坚. 污水处理池中两株细菌的分离及性能鉴定［D］. 成都：西南交通大学，2009.

（责任编辑 杨贤智）

Isolation and identification of bacteria from the rhizosphere soil of Stellera chamaejasme L. in Zhayeba Valley，Lhasa

LU Xu-bo，ZHAO Yang，DEJI Yang-jin，GESANG Zhuo-ma，DE Ji

（School of Science，Tibet University，Lhasa 850000，China）

Study on the microorganisms from rhizosphere soil of Stellera chamaejasme L. can provide reference for the suppression of rampant S. chamaejasme L. Bacteria from the rhizosphere soil of Stellera chamaejasme L. were isolated and purified by dilution plate method，and the purified bacterial strains were identified using classical classification method combined with sequence analysis of the D1/D2 domain of 26S rDNA；data processing and analysis were conducted by Microsoft Excel and SPSS 19.0 software. Results demonstrated that 55 bacterial strains isolated from the soil of S. chamaejasme L. in Lhasa river valley （Zhayeba valley） belonged to Sphingomonas melonis，Pseudomonas sp.，Bacillus cereus，Pseudomonas japonica and Bacillus sp.，among which Sphingomonas melonis was a dominant species. Additionally，there was a certain difference in the population structure of bacteria from the rhizosphere soil of S. chamaejasme L. in Zhayeba valley. In conclusion，the inhibitory effect of S. melonis on S. chamaejasme L. is worthy of further study.

Lhasa；Zhayeba Valley；Stellera chamaejasma；soil；sequence analysis of the D1/D2 domain of 26S rDNA

S154.38+1

A

1004-874X（2016）10-0095-05

2016-07-24

西藏国家级大学生创新实验训练计划项目（201510694006）

卢许波（1994-），男，在读本科生，E-mail：779499064@qq.com

德吉（1972-），女，藏族，讲师，E-mail：1307944864@qq.com

卢许波，赵阳，德吉央金，等. 拉萨扎叶巴沟瑞香狼毒根际土壤细菌的分离与鉴定［J］.广东农业科学，2016，43（10）：95-99.

瑞香狼毒（Stellera chamaejasma）是瑞香科狼毒属植物，分布在我国东北、华北、西北、西南等地区，主要生长在海拔2 600～4 200 m的草坪、滩地和干燥阳坡，西南地区分布于西藏，但

西藏的瑞香狼毒主要产于西藏东部及南部。瑞香狼毒是很强的入侵性毒草，在一些地区已经成为危害性物种。瑞香狼毒根部生长或腐解时都会释放出有毒物质抑制其他植物生长，而且其茎叶也含有有毒物质，牛羊误食后会出现中毒症状，其不仅对草原生态有着不可忽视的破坏，也对牧业有着很大的危害［3-5］。