石油降解菌的筛选鉴定及降解石油的初步研究

张晓敏 成杰民(山东师范大学 山东 济南 250014)

石油降解菌的筛选鉴定及降解石油的初步研究

张晓敏 成杰民(山东师范大学 山东 济南 250014)

根据目前我国石油污染土壤生物修复存在缺少高效石油降解菌及降解微生物之间作用机制也不清楚等主要问题。通过室内模拟石油污染土壤进行微生物修复试验对菌株的石油降解效果进行验证，筛选到高效石油降解菌株S-A-2，并对高效石油降解菌进行生理生化反应的鉴定，经细菌16SrDNA鉴定菌株为嗜麦芽窄食单胞菌菌株JCMS(kf724885.1)。

石油；微生物修复；石油降解菌；菌种鉴定

石油对环境污染，如今可以用危害来形容。20世纪80年代以前，治理石油污染土壤还一般运用物理和化学方法，即热处理和化学浸出法。热处理法可净化土壤中大部分有机污染物，但同时也容易破坏土壤结构和组分，并且昂贵的价格而很难广泛接受和利用；化学浸出和水洗的除油效果也很好，但由于化学试剂的二次污染问题限制了其应用和推广。上世纪80年代以来，因微生物修复技术具有流程简单、价格实惠且二次污染少等很多优势，因此从20世纪90年代开始，从自然界中寻找能够快速降解某些特定污染物的微生物成为研究的热点问题，据报道，能利用烃类的微生物约有30个属100多种。

本试验从石油污染土壤中分离到石油降解菌，并通过形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析对其进行鉴定，以期能为石油污染的微生物修复提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

试验菌株和试验用土均采自山东东营胜利油田油井周围的石油污染土壤。

1.2 菌种的筛选及纯化

1.2.1 富集培养

(1)制备土壤悬液：取土样5g加入100ml原油无机盐液体培养基中，放入恒温摇床培养箱中30℃、120r/min、培养7d，此为第一次富集。

(2)然后按6％(体积分数，下同)的接种量取上一次富集液3ml接至原油无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次培养7d，3次富集培养所用培养基中的石油质量浓度逐步提高，依次为1.5、2.0、2.5g/L。

(3)分离石油降解菌采用稀释平板法，将最后一次富集培养液按十倍稀释法稀释后，取10-3、10-4、10-5四个稀释度下的富集培养液，涂布在油平板上，于30℃恒温培养，每个稀释度富集液设2个重复试验，每隔12h观察石油降解菌的生长情况。

1.2.2 菌株的初筛

油平板上长出菌落后，挑取不同颜色和形态的优势单菌落，在油平板上进行多次划线、分离、纯化，以得到形态一致的纯化菌株并编号；纯化后的菌株保存在牛肉膏蛋白胨培养基上备用。

1.2.3 菌株的复筛

取纯化好的菌株于100ml原油无机盐液体培养基中，原油浓度为3g/L，放入恒温摇床培养箱中30℃、120r/min、培养7d，完成最后一次驯化，将培养后的菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基中备用，接种量0.1ml。

1.2.4 菌种的纯化

(1)取一环最后一个周期驯化的培养液，在含油平板上划线，30℃培养7d，反复多次。

(2)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落。

(3)纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，培养24 h后，保存在4℃冰箱，备用。

1.3 菌种的鉴定

1.3.1 形态及生理特征鉴定

(1)对筛选出的菌种进行形态学观察及生理生化实验，依照伯杰氏细菌鉴定手册，对筛选到的菌种进行鉴定，初步鉴定到属。

(2)用显微镜(革兰氏染色)观察细菌形态学特征

(3)生理生化特征测定

1.3.2 16S rDNA全序列系统学分析

(1)16S rDNA的提取：菌株在30℃ LB液体培养基中振荡培养至对数生长期，取1.5ml培养物12000 r·min-1离心，收集菌体。用细菌基因组DNA小量快速提取试剂盒进行提取(具体步骤依据产品说明书进行)。提取后的DNA于-20℃保存，备用。

(2)序列测定及同源性比较：16SrDNA的序列由上海生物工程股份有限公司测定。测序结果在GenBank上与已知种属的16SrDNA进行BLAST，对获得的同源序列进行分析并构建进化树。

1.4 石油降解菌降解石油效率的测定实验

1.4.1 绘制标准曲线

称取1g石油溶于100ml石油醚中，作为基准用油；分别稀释至0.2、0.1、0.02、0.01、0.001、0.002g/L，用紫外分光光度计测定其吸光度，作出原油浓度—吸光度标准曲线；根据回归曲线求得吸光系数K。

1.4.2 紫外分光光度法测定菌株降解率

(1)将一定体积的石油醚加入水样中，盖好瓶塞，充分振荡。使吸附在平壁上的油渍全部溶解后，将水样和石油醚全部转移到分液漏斗中，加入1：1盐酸调制PH值小于2，用一定量石油醚清洗取样瓶，将溶液全部转入分液漏斗中；加入适当氯化钠破坏乳化层以提高萃取效果。

(2)充分振荡分液漏斗并且不断放气，待水样中油质全部溶解后，将分液漏斗放回漏斗架，使之静置分层，放置30min以上。将水层转入取样瓶中，萃取液转入100ml具塞刻度比色管中。

(3)再次将水样转入分液漏斗中，加入适量的石油醚，重复(2)操作，直至萃取液无色为止。收集全部萃取液与具塞刻度比色管中，加石油醚至100ml；如果萃取液浑浊，可加入无水硫酸钠到不结块为止，加盖后放置30min以上，以便脱水，然后用预先以石油醚洗涤过的定性滤纸过滤，收集滤液进行比色。

(4)将被测水样的萃取液用石油醚稀释100倍后进行比色，装入玻璃比色皿中，用石油醚做空白溶液在分光光度计上测量其吸光度E，波长为265mm。若萃取液颜色较深，用石油醚稀释若干倍后进行比色。如果萃取液浑浊，可加入无水硫酸钠到不结块为止，加盖后放置30min以上，以便脱水，然后用预先以石油醚洗涤过的定性滤纸过滤，收集滤液进行比色。以石油醚为参比液测定吸收值，将测得的吸收值在标准曲线上对照查得含油量，计算石油的降解率，最终选取降解率最高的一株菌作实验用。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质测定

(1)土壤pH值测定

表1 土壤pH测定数值

由图表可知，本实验采取的山东东营胜利油田油井周围土壤的PH值为8.13，偏碱性。

(2)土壤含水率及含油量的测定

表2 晾干后200ml三角瓶质量

表3 加入10g土壤样品后三角瓶的质量

表4 土样烘干后三角瓶质量

表5 石油醚烘干后三角瓶质量

土 壤 含 水 量 ＝(0.3684+0.3530+0.3182)/3 ＝0.3465g

土壤含水率＝(0.3465/10)*100％＝3.47％

土 壤 含 油 量 ＝(0.4563+0.3975+0.4682)/3 ＝0.4407

土壤含油率＝(0.4407/10)*100％＝4.41％

由实验测得数据计算可得土壤含油率1.92％，土壤含水率3.47％。

(3)土壤有机质含量的测定

空白滴定消耗硫酸亚铁体积V0＝26.4ml

样品滴定消耗硫酸亚铁体积V＝21.6ml

根据1.3.3公式计算可得，土壤中有机质含量为33.02g/kg。

2.2 高效石油降解菌的筛选与纯化

(1)筛选菌株形态观察及生理生化特征

表6 细菌形态及生理生化特征

(2)原油浓度—吸光度标准曲线的绘制

运用MATLAB2015基于最小二乘法的线性拟合方法得到该曲线，Y=0.7054*X+0.0357其中R=0.9969>99％，数据可用。由此可得，吸光系数K=0.7054。

(3)紫外分光光度法测定菌株降解石油的效率

图1 原油降解率测定标准曲线

表7 复筛菌株降解石油的百分比

3 菌株16S rDNA序列系统学分析及鉴定

对获得的同源序列进行分析并构建进化树：

图2 菌株16S rDNA鉴定系统发育树

由实验所得数据可知，A2的降解效率最高，因此挑选A2作为被测试菌株，编号S-A-2。

4 讨论

(1)石油污染土壤样品中分离所得菌株，用无机盐培养基进行富集培养、初筛、复筛，筛选后经平板反复划线分离，获得一株石油降解菌S-A-2。分析鉴定菌株经过生理生化实验，初步鉴定到属，结果为单胞菌属，再进行16S rDNA全序列系统学分析，确定其为嗜麦芽窄食单胞菌菌株JCMS(kf724885.1)

(2)当前石油污染状况越来越严重，石油污染土壤中的微生物中细菌一般体积小、数量大、生长代谢快，相比较其他微生物有培养的优势，所以石油降解菌选择细菌，其它的石油降解菌株是否具有更高效的降解效果还有待考究。

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Preliminary Research on Screening and Identification of Oil-degrading Bacteria and Degradation of Oil

ZhangXiaomin(Shandong Normal University JiNan ShanDong 250014)

The paper discusses the current situation of petroleum contaminated soil in China and the problems existing in microbial remediation of petroleum contaminated soil such as lack of high efficient oil degradation bacteria and the mechanism of degrading microorganisms being not clear.We obtain crude oil degradation strain with isolating and screening method and obtain strain S-A-2 by further screening according to the main components of oil.We verify oil degradation effect of the strain through indoor simulation of bioremediation experiment of oilcontaminated soil，identify the physiological and biochemical reactions of high effect oil degradation bacteria and confirm the bacteria as Stenotrophomonas maltophilia strain JCMS (KF724885.1) by bacteria 16S rDNA.

Oil Microbial remediation Oil degradation bacteria Identification of bacteria

X703.1

A

1674-263X(2016)04-0072-04

2016-12-20

张晓敏(1993-)，女，研究生，工作单位：山东师范大学。