超高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留

杨卫军，李　曼，曹秀梅，林艳青

（河北省秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心，河北　秦皇岛　066000）

超高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留

杨卫军，李曼，曹秀梅，林艳青

（河北省秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心，河北秦皇岛066000）

本研究建立了检测鸡肉中氟喹诺酮类药物的超高效液相色谱分析方法，样品采用磷酸盐缓冲溶液提取，提取液经Bond Elut C18固相萃取柱富集净化，在荧光检测器下进行定性与定量分析。结果表明，该方法对4种氟喹诺酮类药物在0.000 2～0.5 g/m L范围内呈良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0.999 8，在3个添加水平范围内的回收率为67.6%～97.1%，相对标准偏差为3.1%～5.4%，方法检出限为3 g/kg，定量限为10 g/kg。

超高效液相色谱法；氟喹诺酮类；鸡肉；残留

氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones,FQs）是感染性疾病的治疗药物，但由于其具有促进动物生长、改善动物产品品质、降低动物发病率及死亡率等作用，常被作为饲料添加剂用于饲料中[1-4]。该类药物的滥用以及使用后未严格实行休药期制度，常常导致其在动物性食品中的残留超标。农业部235号公告规定了鸡肉中达氟沙星、恩诺沙星和沙拉沙星的最高残留限量分别为200、100和10μg/ kg。人们如果长期食用残留超标的动物性食品，就会对人体造成一系列不同程度的毒副作用，如对人体的中枢神经系统及心血管系统造成不良反应，甚至致癌[5-8]。

目前，鸡肉中氟喹诺酮类药物残留检测采用高效液相色谱法，该方法检测耗时长，检测效率低。随着超高效液相色谱检测技术的出现，已经应用到各个领域，该技术与传统的HPLC相比，在速度、灵敏度和分离度方面大大提高，它不仅缩短了分析时间，同时也减少了溶剂用量，降低了分析成本，提高了工作效率。本文借鉴农业部现行有效标准动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测-高效液相色谱法（农业部1025号公告-14-2008）中的前处理方法及检测过程，建立了鸡肉样品中4种氟喹诺酮类药物残留的超高效液相色谱快速测定方法，为鸡肉中氟喹诺酮类药物残留检测提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂鸡肉（去除脂肪），采自农贸市场；环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星标准品（纯度均≥99%，中国兽医药品监察所）；乙腈（HPLC级，美国Fisher公司）；甲酸（色谱纯，Dikmapure）；其他试剂均为优级纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；试验用水为经Mil l i-Q净化系统过滤的去离子水；Varian BondElut C18固相萃取柱（100 mg/mL，安捷伦科技有限公司）。

1.2仪器与设备ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Mi l l i-Q超纯水器（美国Mil l ipore公司）；TGL-20M台式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；漩涡混合器XW-80A（上海青浦扈西仪器厂）；超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；AY-5多用调速振荡器（江苏省金坛市医疗仪器厂）；GX-274自动固相萃取仪（美国吉尔森公司）。

1.3色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；柱温30℃；检测波长：激发波长280 nm，发射波长450 nm；流动相为0.1%甲酸：乙腈（v:v）=86:14；流速0.35 mL/min；进样体积5μL。

1.4样品提取与净化称取绞碎试样2.00 g，加入10.0 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.0），在振荡器上中速振荡5 min后，以12 000 r/min离心5 min，移取上清液至另一离心管中；向残渣中加入10.0 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.0），重复上述操作一次，合并上清液。固相萃取柱的活化：依次用甲醇、磷酸盐缓冲溶液各2.0 mL淋洗；取5.0 mL上清液进行上样；用水1 mL淋洗，并挤干；最后用1.0 mL流动相洗脱，挤干，收集洗脱液，流速均控制在1.0 mL/min。洗脱液最后过0.22μm混合微孔滤膜，上机进行测定。

1.5标准曲线的绘制准确称取4种氟喹诺酮类药物标准品，用0.03 mol/L氢氧化钠溶液溶解并定容，用流动相将环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星都分别稀释成0.001、0.010、0.050、0.100、0.300和0.500μg/mL，达氟沙星稀释浓度为0.0002、0.002、0.010、0.020、0.060和0.100μg/mL，采用超高效液相色谱测定。以各组分的色谱峰面积对浓度做线性回归方程并绘制标准曲线，采用向空白样品中添加不同浓度标准溶液进行检测，根据色谱图信噪比计算方法的检出限和定量限。

1.6方法学验证通过对样品添加回收率试验进行方法学验证，验证的效能指标包括回收率、精密度。向空白鸡肉样品中添加不同浓度的氟喹诺酮类标准溶液，做添加回收试验，使其样品添加浓度为10、50和100μg/kg，每个浓度做3个平行试验。

2　结果与讨论

2.1色谱分离条件的优化由于FQs中含有羧基和可质子化的氮，属于两性化合物，在流动相的选择上多采用磷酸盐缓冲溶液或经乙酸调pH的水溶液，然而，通常仅调节pH的情况下，C18柱上不能得到良好分离，普遍存在出峰过早、标准品之间分离不完全、峰拖尾等情况。有文献报道多采用磷酸/三乙胺、磷酸盐/四丁基溴化铵等以改变FQs的保留因子并抑制色谱峰拖尾。由于超高效液相色谱仪的管路较常规液相色谱仪的管径细，且盐溶液容易析出并堵塞管路，影响正常检测，因此经过试验，最终流动相确定为0.1%甲酸:乙腈（v:v）=86: 14，亦可以得到良好的峰形和分离度，采用等度洗脱方式6 min之内就可以实现对4种FQs的分离检测，见图1。而高效液相色谱法的检测时间大概需要25 min，与普通高效液相色谱法相比，该方法大大缩短了检测时间，高效液相色谱图如图2。

2.2标准曲线、检出限和定量限环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星在浓度0.001～0.5μg/mL，达氟沙星在浓度0.000 2～0.1μg/mL范围内4种氟喹诺酮类药物的峰面积（Y）与浓度（x）呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999 8（见表1）。向空白样品中添加不同浓度的FQs标准溶液进行检测，当添加环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的浓度为3μg/kg时，色谱图信噪比约等于3，此时的方法检出限为3μg/kg：当添加环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的浓度为10μg/kg时，色谱图信噪比大于10，此时的方法定量限为10μg/kg。

2.3回收率试验精密称取2.00 g空白样品，向其中添加不同浓度的混合标准储备液（添加浓度分别为10、50和100μg/kg），按试验方法测定含量，平均回收率为67.6%～97.1%，相对标准偏差（RSD）为3.1%～5.4%，见表2，样品空白和样品添加色谱图如图3和图4所示。

图1　4种氟喹诺酮类药物混合标准样品的色谱图Fig.1　Chromatogram of standard samp les from fluoroquinolones

图2　4种氟喹诺酮类药物混合标准样品的色谱图Fig.2　Chromatogram o f standard sam ples from fluoroquino lones

表1　4中氟喹诺酮类药物线性方程和相关系数Tab le1　Linear relationship and corre lation coe fficient of fluoroquinolones

表2　4种氟喹诺酮类药物的回收率和相对标准偏差Table2　Recoveries and relative standard deviations of fluoroquinolones

图3　鸡肉空白样品色谱图Fig.3　Chromatogram of samp les from chicken

图4　鸡肉中添加4种氟喹诺酮类药物色谱图Fig.4　Chrom atogram from sam p les of spiked levels

3　结论

本文建立了一种同时测定鸡肉中4种残留的FQs超高效液相色谱检测法（UPLC）。与普通液相法比较，该方法全面提升了液相色谱的检测速度、灵敏度和分离度，重现性好、稳定性高，大大缩短了分离时间，能够满足对鸡肉组织中FQs残留分析的要求，同时减少了溶剂用量、降低了分析成本，有效地提高工作效率。

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Discussion on Determ ination of Fluoroquinolones Residues in Chicken by Ultra-performance Liquid Chromatography

Yang Wei jun,Li Man,Cao Xiumei,Lin Yanqing
(Qinhuangdao Agricul tural Product Quality Safety Supervision and Inspection Center,HebeiQinhuangdao066000)

An ul tra high per formance l iquid chromatographic(UPLC)method for determination of f luoroquinolones residues in Chicken has been developed,Samples were extracted by phosphate buffer solution.Ext ract was enriched and puri fied in Bond Elut C18,Qual itative and quantitative analysis on the f luorescence detectors were car ried out.The resul ts show that f luoroquinolones has good linear relationship between 0.000 2～0.5μg/mL.The cor relation coef f icient was r2＞0.999 8.The average recovery at the three spiked levels was in the range of 67.6%to 97.1%.The relative standard deviations were f rom 3.1%to 5.4%.The l imits of detection for f luoroquinolones were 3μg/kg.The l imits of quanti f ication were 10μg/kg.

UPLC;Fluoroquinolones residues;Chicken;Determination

S859.84

B

1672-9692(2016)04-0008-05

2016-03-09

杨卫军（1981-），男，河北秦皇岛人，硕士研究生，兽医师，主要从事农产品质量安全检测工作。