微小组织冰冻快速制片技术

郑晖，周丽，颜亚晖，2，曹盼盼

（1中南大学湘雅医院病理科，长沙 410078；2中南大学基础医学院病理学系，长沙 410078）

微小组织冰冻快速制片技术

郑晖1，2*，周丽1，颜亚晖1，2，曹盼盼1

（1中南大学湘雅医院病理科，长沙 410078；2中南大学基础医学院病理学系，长沙 410078）

目的 摸索提高微小组织冰冻快速制片质量的方法。方法 针对小组织冰冻切片中常常出现组织切完、多粒组织切片不全、冰晶、染色不均匀等问题，采用预先制作冷冻平台、快速冷冻等方法来制作优质的冰冻切片。结果 组织铺平可使组织切片完整，快速冷冻可减少冰晶形成，使组织结构更清晰，及时固定和加温染色可使细胞核染色更鲜艳，核、质对比明显。结论 组织铺平、速冻、固定、染色等都是提高微小组织制片质量的关键。

微小组织，冰冻快速制片

随着冰冻快速制片技术在病理诊断中的广泛应用及各种内镜穿刺检查的广泛开展，微小组织冰冻快速制片病例越来越多。由于纤维内镜和穿刺组织细小，黏液、纤维成分较多，给制片和诊断带来一定的困难，常出现组织切完、多粒组织切片不全、冰晶、染色不均匀等现象，为解决上述问题，提高微小组织冰冻切片的质量，我们经过反复实践和摸索，获得了一些经验。

材料和方法

1 微小组织来源

微小组织来源于湘雅医院临床穿刺活检标本，包括乳腺、肾穿、胃肠镜、喉镜、膀胱镜、肝穿、胰腺、甲状腺等穿刺标本。

2 仪器

冰冻切片机（LEICA CM 195），工作前将温度设置为-20～-25℃。

3 试剂

酒精福尔马林冰醋酸（alcohol formalin glacial acetic acid，AAF）混合固定液：95%酒精80mL＋福尔马林15 mL＋冰醋酸5 mL混合。

4 标本前期处理

先在冷冻头上平铺薄层冰冻切片包埋剂（普通胶水），冻硬后修平，用吸水纸吸干微小组织中的水分，如果是胃肠镜、喉镜、膀胱镜获取的多粒新生组织，须将组织一点一点快速平放于刚修好的冷冻头上；如为肾穿、肝穿、乳腺穿刺的长条形组织，则须一条一条整齐的排列于刚备好的冷冻头上，不要互相重叠，再补加少量包埋剂使组织全部被包裹，按下速冻键，加上速冻器速冻几秒即可。

5 切片染色

将锋利无缺口的刀片预冷；切片前调整好组织与刀片的角度，这是微小组织冰冻切片准备中极为重要的步骤。对于穿刺条索状组织应与刀片垂直或成60度角，这样易使切片拉平，含脂肪的组织脂肪放在最后接触刀口；切片时使用螺旋扭慢慢修切，待组织刚暴露时切一张4～5μm薄片，贴于载玻片的左边，稍修切，待组织充分暴露时再深切一张同样的薄片贴于玻片右边，这样每张载玻片上都贴有深浅各一的组织一片，用AAF固定液立即固定，常规HE染色，注意染色前苏木素染液须预温到60℃。待病理医生报告结果后将剩余组织洗干净胶水，再用擦镜纸包好放入10%中性福尔马林固定液中固定做石蜡切片。

结 果

为了解决微小组织冰冻制片中常常出现切片不全、冰晶、染色不均匀等问题，采用预冻包埋平台、吸水、速冻组织等方法制作出优质的冰冻切片。我们发现预先制作冷冻平台平铺组织可使多粒组织切全且组织不会切完（图1A，图1B）；用吸水纸吸干小组织中的水分和快速冷冻可以减少组织中的冰晶（图1C），由此解决了过去微小组织冰冻制片中常常出现切片不全、冰晶孔隙挤压周围组织而改变组织原来的形态结构等问题（图1D）

图1　微小组织冰冻制片。A，组织包裹在胶水中；B，组织切片后肉眼观；C，HE染色微小组织冰冻切片光镜观；D，冰晶挤压周围组织HE染色光镜观；比例尺，100μmFig.1　Preparation of frozen sections of small tissues.A，tissues embedded in glue；B，naked eye view of the tissue sections prepared；C，light microscopic view of an HE stained frozen section of small tissue；D，light microscopic view of HE stained tissue extruded by ice crystals；scale bar，100μm

讨 论

对于微小组织制作冰冻快速制片，要做到既要将每一点小组织切全，又不将组织切完。在取材前，预先在冷冻头上平铺薄层胶水冻好并修平，可垫高组织并使小组织平铺于包埋剂中，便于组织切全且不使组织切完，否则容易出现有的组织已切完而有的组织还没切到，同时可防止刀刃切到冷冻头而造成机器损伤。在冰冻快速制片中如何消除冷冻组织内的冰晶是病理技术人员要解决的一个难点。生物体内细胞中水分占80%～90%，水在各种组织中含量都很多，冷冻过程中组织中的水分常会形成冰晶孔隙挤压周围组织，改变甚至破坏组织原来的形态结构而影响制片质量。为了减少组织内冰晶的产生，我们用吸水纸吸干组织中的水分，立即按下速冻键，加上速冻器快速冷冻可大大减少了冰晶形成，因使组织温度急速下降到冷冻切片所需要的温度，是防止冰晶形成最简便易行且效果最确切的好办法［1］，所以在制片时必须使组织在极短的时间内骤冷速冻，才能避免冰晶的干扰，组织结构才能清晰，细胞形态才能完好。

为了制作出高质量的冰冻切片，除严格按上述方法外，应注意如下几点：①注意冷冻时间和温度，不同组织需要冷冻的时间和温度不同，普通小组织其冷冻温度一般-20～-22℃，脂肪组织一般-25～-30℃，冷冻时间需更长［2］。冷冻不够，组织会皱成一堆，细胞堆集。冷冻过度，会使组织变脆。可用指腹置于组织块表面使组织复温。②及时固定切好的组织，在干净的载玻片上贴附后应立刻放入固定液中固定，勿使切片在空气中干燥，否则会造成细胞核在空气中发生退变，细胞着色力下降，导致染色后细胞核模糊不清［3］，影响镜检和诊断。③苏木素预温，可大大缩短染色时间，且加温染色可使组织蛋白质变性，细胞核染色更清晰透明，碳酸锂返蓝后水洗要充分，否则伊红着色不均匀。

冰冻快速制片受时间的限制，要沉着冷静，不要急于求成，否则适得其反。工作中加强责任心，注意发现问题，积累经验。我们严格按照上述方法基本解决了微小组织制片中存在的问题，且整个制片过程只需7～8min，真正做到了快速、准确。

［1］田玉旺，丁华野，李琳，等.一种减少冷冻切片组织内冰晶的处理方法.临床与实验病理学杂志，2002，18（5）：567-568.

［2］陈杰，郑莉，张惠.浅谈冷冻制片中常见问题与处理.临床与实验病理学杂志，2010，26（4）：502-503.

［3］陈淑敏，李凤朝，李琳琳，等.术中快速冷冻制片技术要点.徐州医学院学报，2013，33（1）：63-64.

Techniques for preparing quick frozen sections of small tissues

Zheng Hui1,2*,Zhou Li1,Yan Yahui1,2,Cao Panpan1
（1Department of Pathology，Xiangya Hospital，2Department of Pathology，Basic medical school，Central South University，Changsha 410078，China）

Objective To explore methods to improve the quality of quick frozen sections of small tissues.MethodsProblems occur frequently in the preparation of frozen sections for small pieces of tissue,such as tissue depletion,incomplete sectioning of multiple tissues,ice crystals and uneven staining.To make high quality frozen sections,several approaches were tried out including preparation of the frozen platform in advance and quick freezing.ResultsFlattering tissue on frozen platform helps to keep tissue section integrity；quick freezing helps to reduce ice crystals in tissue and produce nice sections；brighter cell nuclei and strong stain contrast between the nucleus and cytoplasm were obtained by fixing tissue in time and warming up the staining solution.Conclusion Tissue flattening,quick freezing,fixation and staining are all critical to improving the quality of frozen sections of small tissues.

Small tissue；quick frozen section

R329.33

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.015

2015-11-12

2016-10-10

郑晖，女（1963年），汉族，高级实验师

（To whom correspondence should be addressed）：zhenghui7388＠163.com