磁分散固相微萃取―紫外可见分光光度法检测水样中的孔雀石绿

祁　嫒，申江萍，段翔洋，张泽宁，刘晓慧，许宝香

（山西师范大学 化学与材料科学学院，山西 临汾 041000）

磁分散固相微萃取―紫外可见分光光度法检测水样中的孔雀石绿

祁嫒，申江萍，段翔洋，张泽宁，刘晓慧，许宝香

（山西师范大学 化学与材料科学学院，山西 临汾 041000）

建立了磁分散固相微萃取技术与紫外―可见分光光谱法相结合的方法来检测水样中孔雀石绿的含量，在实验中详细研究了pH值、磁性材料用量、萃取时间、解析剂种类和用量、解析时间、离子强度等因素对水样中孔雀石绿萃取效率的影响。在最佳条件下验证发现孔雀石绿在0.01～0.3 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数为0.996 3，因此本方法具有较宽的线性范围和良好的线性相关系数，以及具有较高的灵敏度和准确性，可用于水样中孔雀石绿的检测。

磁分散固相微萃取；紫外―可见分光光度法；富集；孔雀石绿

孔雀石绿与碱性三苯甲烷类染料具有相似的结构（如图1所示）[1]，它曾经被广泛应用于皮革、纺织、制陶等行业，并用作细胞化学染色剂和食品颜色剂等，孔雀石绿还具有抗菌和杀虫的功效，在药用染料中具有很强的抗菌能力[2]，因此鱼卵中的霉菌以及水产动物体外的原生动物、寄生虫等均可以使用孔雀石绿来杀灭[3]。但是孔雀石绿在人体或者动物体内经过转化后，代谢成了无色孔雀石绿，无色孔雀石绿会产生毒素并且残留在人体内部，同时它也会致畸、致癌和致突变[4]，很大程度的危害了人类的身体健康。它被列入致癌实验研究的化合物行列之中，也成了众多国家水产养殖行业中的禁用药物之一[5]。因此，建立一种操作简单、准确性高的方法来检测孔雀石绿含量具有很大意义。

图1　孔雀石绿结构式

目前所使用的样品前处理方法有很多，其中用来测定水样中孔雀石绿含量的样品前处理方法有浊点萃取、固相微萃取、分子印迹固相萃取、分散液液微萃取等[6-9]。磁分散固相萃取技术自1973年被报道后，人类就广泛关注磁性材料，随着纳米科学技术的发展，产生了磁性纳米材料，它是由纳米技术与磁性材料结合而产生的。随后人们便用磁性纳米材料作为一种吸附剂而建立了磁性固相萃取技术[10]。与其他萃取方法相比较，磁性固相萃取技术具有诸多优点，如分离迅速、传质速度快、在溶液中分散性能好、材料可重复使用等优点[11]。

到目前为止，用磁分散固相萃取技术与紫外―可见吸收光谱法相结合来检测水样中孔雀石绿含量的报道较少。本文采用磁性固相萃取技术与紫外―可见分光光谱法相结合的方法，对水样中的孔雀石绿进行分离富集和分析测定。

1　实验

1.1试剂与仪器

凹凸棒粘土粉购自中国南京亚东奥土矿业公司；孔雀石绿购自中国天津市化学试剂一厂；自配0.04 mol/L三酸缓冲溶液；鱼塘水、湖水均取自山西临汾；乙醇、丙酮、甲醇、氯化钠均为分析纯，并且都购自中国洛阳市化学试剂厂。

紫外―可见分光光度计购自澳大利亚varian australia公司，超声波清洗器（KH-500B型）购自中国昆山禾创造声仪器公司。

1.2孔雀石绿标准溶液的配置

用分析天平准确称取孔雀石绿标准样品10 mg，放入烧杯中加蒸馏水并超声处理至孔雀石绿充分溶解。再将上述孔雀石绿溶液倒入100 mL的容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度线，充分摇匀，配成100 μg/mL 的孔雀石绿标准溶液；再将上述孔雀石绿标准溶液稀释成一系列所需浓度并置于4℃下避光保存。

1.3环境水样的处理

用孔径为0.45 μm的滤膜将湖水和鱼塘水进行真空抽滤，得到水样置于4℃下避光保存。

1.4磁性材料的制备

根据文献[12]进行磁性材料的制备，在24 mL 的乙二醇中加入纯化的粘土0.3 g，然后将0.6 g 的FeCl3·6H2O和1.2 g 的NaAc在环境温度下溶解于乙二醇溶液中。用磁力搅拌器搅拌该溶液30 min 后，将该溶液转移至50 mL聚四氟乙烯内衬中，放入不锈钢反应釜中，设置反应釜的温度为200℃，使上述溶液反应8 h，然后自然冷却至室温。再将固体和溶液用外部磁场分离，倒掉上清液，并用乙醇将得到的固体清洗数次后在温度为60℃下进行真空干燥。

1.5实验过程

用移液管准确量取8 mL处理过的水样并放于试管中，先加入pH值为2的缓冲溶液2 mL，然后加入磁性材料4 mg，用超声波处理器处理2 min ，使磁性材料分散充分，静置萃取10 min，再迅速用磁铁将磁性材料吸至比色管一侧。倒掉上清液，加入0.3 mL 的丙酮溶液，超声处理1 min 使磁性材料在丙酮溶液中充分分散，再静置解析8 min，最后用紫外―可见分光光度计测定其解析液的吸光度值。

2　结果与讨论

2.1萃取条件优化

在本文中详细研究了pH值、磁性材料用量、萃取时间、解析剂种类和用量、解析时间、离子强度等因素对水样中孔雀石绿萃取效率的影响，结果如下。

2.1.1pH值的影响

研究了水样的pH值大小对水样中孔雀石绿萃取效率的影响情况。从图2可以看出，pH值为2时萃取效率最高，当增大pH 值时，孔雀石绿的萃取效率依次减小， 因此本实验的最佳pH值为2。原因可能是孔雀石绿在酸性条件下带两个正电荷，由于静电相互作用，可与凹凸棒粘土表面的羧基形成稳定的离子对，所以pH值为2时，孔雀石绿的萃取效率最高。

图2　pH值对萃取效率的影响

图3　磁性材料用量对萃取效率的影响

2.1.2磁性材料量的影响

磁性材料的用量会很大程度的影响萃取效率，因此确定使用多少磁性材料是必须的。在6个比色管中分别放入10 mL 浓度为0.8 μg/mL 的孔雀石绿标准溶液，然后在比色管中分别加入磁性材料1、2、3、4、5、6 mg 进行萃取实验，最后测定其解析液的吸光度。结果如图3所示，在磁性材料用量为1～4 mg 之间，随着磁性材料用量的增加，水样中孔雀石绿的萃取效率越来越高；而在4～6 mg 之间，随着磁性材料用量的增加，萃取效率基本保持稳定不变。原因是磁性材料少于4 mg 时，水样中的孔雀石绿没有完全吸附在磁性材料上；磁性材料达到4 mg 时，达到吸附平衡；当磁性材料大于4 mg 时，磁性材料量太多，解析剂的量较少，不能完全解析吸附在磁性材料上的孔雀石绿，萃取率有所降低。因此本实验采用的磁性材料用量为4 mg。

2.1.3萃取时间的影响

在其他条件不变的情况下，考察了在萃取时间为4～14 min 之间水样中孔雀石绿的萃取效率。研究结果如图4所示，在4～10 min 内随着萃取时间的延长水样中孔雀石绿的萃取效率也增大，当萃取时间超过10 min 时，萃取效率基本保持稳定。原因可能是在萃取前期，磁性材料表面存在着大量吸附位点。随着萃取时间的延长，孔雀石绿分子间产生竞争吸附，当时间超过10 min 萃取效率增加缓慢，呈平缓状态基本上达到平衡，因此本实验采取的最佳萃取时间为10 min。

图4　萃取时间对萃取效率的影响

图5　解析剂种类对萃取效率的影响

2.1.4解析剂种类和用量的影响

由于孔雀石绿溶解于乙醇、 甲醇、丙酮等有机溶剂[13]，所以考察了乙醇、丙酮、甲醇这三种解析剂对解析效率的影响。结果如图5所示，解析效率最好的为丙酮，因此本文采取的解析剂为丙酮，其原因是孔雀石绿在丙酮中的溶解度较大。同时对解析液的用量进行了研究，分别取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL的丙酮作为解析剂进行测定。实验结果发现用0.3 mL的丙酮就可以完全解析磁性材料上的孔雀石绿，为了减少成本，本文采用的解析剂用量为0.3 mL。

2.1.5解析时间的影响

在其他条件不变的情况下，研究了孔雀石绿在2～12 min 解析时间内的解析效果。结果如图6所示，在解析时间为2～8 min内水样中孔雀石绿的解析效率逐渐升高，当解析时间超过8 min 时，解析率基本保持稳定不变，因此本实验采取的最佳解析时间为8 min。原因可能是在2～8 min 内，解析时间较短，磁性材料不能充分分散，不能完全解析，当解析时间达到8 min 时，完全解析，在8 min 以后的时间内解析效率基本保持不变。

图6　解析时间对萃取效率的影响

2.1.6离子强度的影响

本文考察了水样的NaCl质量分数分别为0%、5%、10%、15%、20%时孔雀石绿的萃取率，结果发现当水样中不加NaCl时，即溶液的NaCl质量分数为0%时，孔雀石绿的萃取效率最好，原因可能是盐的存在使溶液的粘度增大，减小了溶液的扩散系数，使萃取能力降低[14]。因此本文选择不加NaCl。

2.2准确度与精密度

用孔雀石绿和空白水样配置出浓度分别为0.01、0.03、0.06、0.1、0.14、0.22、0.26、0.28 μg/mL 的溶液，在最优条件下进行分析检测，得到此方法的线性方程为A＝3.284c＋0.0010，线性范围为0.01～0.3 μg/mL，线性相关系数为0.996 3，表明了孔雀石绿在此动力学范围内具有良好的线性关系。

用一系列空白水样在最优条件下进行实验，得出此方法的日内重复性为2.6%，日间重复性为5.7%，检出限为0.003 μg/mL，定量限为0.01 μg/mL；因此本方法具有良好的有效性。

2.3实际样品的分析检测和加标分析检测

表1　水样中孔雀石绿的加标回收率和相对标准偏差

如表1，通过对湖水和鱼塘水中孔雀石绿的分析，发现水样中均未检测出孔雀石绿，因此对样品进行了加标分析检测，将0.12、0.18、0.24 μg/mL的标准溶液分别加在湖水和鱼塘水中，在最优条件下对水样进行分离富集和分析测定，每一个浓度水样平行测定5次，计算每个浓度下水样的加标回收率、平均加标回收率及相对标准偏差。实验结果如图表1表示湖水和鱼塘水的加标回收率是88.7%～109.6%，平均加标回收率都在93.7%～105.9%之间，而且相对标准偏差均小于3.9%。实验数据表明可以用磁性固相萃取技术与紫外―可见分光光谱法相结合的方法来检测环境水样中孔雀石绿的含量。

3　结论

经过上述研究得知此方法的检出限是0.003 μg/mL，定量限是0.01 μg/mL，线性方程为A＝3.284c＋0.001 0，线性相关系数为0.996 3，线性范围为0.01～0.3 μg/mL，加标回收率都在88.7%～109.6%之间，表明此方法的精确性高、分析时间短、简单易操作、准确性高、灵敏度高、重现性好。可以用来作为检测孔雀石绿含量的方法。

[1] 张志刚, 施 冰, 陈鹭平, 等. 液相色谱法同时测定水产品中孔雀石绿和结晶紫残留[J]. 分析化学, 2006(5): 663-667.

[2] 翟毓秀, 郭莹莹, 耿霞, 等. 孔雀石绿的代谢机理及生物毒性研究进展[J]. 中国海洋大学学报, 2007, 37(1): 27-32.

[3] 邱绪建, 林洪, 王联珠, 等. 孔雀石绿及其代谢物无色孔雀石绿在鲫鱼肌肉中的代谢规律[J]. 中国海洋大学学报, 2006, 36(5): 745-748.

[4] 崔松荆. 辽宁省淡水鱼中孔雀石绿残留量检测[J]. 安徽农业科学, 2014, 42(13): 3916-3917.

[5] 翟毓秀, 张翠, 宁劲松, 等. 水产品中的孔雀石绿残留及其研究概况[J]. 渔业科学进展, 2007, 28(1): 101-108.

[6] 陈建伟, 姚志云, 毛建伟, 等. 浊点萃取-高效液相色谱法测定虾肉中孔雀石绿和结晶紫残留的研究[J]. 南京农业大学学报, 2010, 33(1): 94-98.

[7] 陶艳玲, 邓爱妮, 刘秋梅, 等. 固相微萃取-高效液相色谱法快速测定水中孔雀石绿[J]. 理化检验, 2011, 47(9): 1092-1097.

[8] 肖琴, 林一, 郑琳, 等. 分子印迹固相萃取—高效液相色谱法检测鱼肉中的孔雀石绿和结晶紫[J]. 粮油食品科技, 2011, 19(6): 31-34.

[9] 莫利, 杨迎春, 韩静, 等. 分散液液微萃取-分光光度法测定环境水样中孔雀石绿[J]. 光谱实验室, 2011, 28(1): 205-209.

[10] Robinson P J, Dunnil L P, Lilly M D. The properties of magnetic supports in relation to immo-bilized enzyme reactors[J]. Biotechnology and Bio-engineering, 1973(15): 603-606.

[11] 黄倩, 何蔓, 陈贝, 等. 磁固相萃取-气相色谱-火焰光度检测联用测定果汁中的有机磷农药[J]. 色谱, 2014, 32(10): 1131-1137.

[12] Jinfeng Zheng, Hao Wu, Nannan Gao, et al. Extraction of pazufloxacin mesilate using magnetic attapulgit clay nanoparticles prior to determination by fluorimetric detection[J]. Analytical Chemistrt, 2016, 16(5): 183-191.

[13] 王丽玲, 冯翠霞, 胡尔萍. 水样中孔雀石绿残留量测定方法探讨[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(10): 1809-1810.

[14] 郭萌萌, 刘雪卉, 吕运开, 等. 磁分散萃取-液相色谱法测定食品接触材料中3种酚类物质迁移量[J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(1): 285-290.

Magnetic Solid Phase Micro Extraction Followed by UV-vis Spectrophotometry for Determination of Malachite Green in Water

QI Ai, SHEN Jiang-ping, DUAN Xiang-yang, ZHANG Ze-ning, LIU Xiao-hui, XU Bao-xiang
（School of Chemistry And Material Science, Shanxi Normal University, Linfen 041000, China）

A novel method of magnetic solid phase micro extraction/UV-vis spectrophotometry was developed for the determination of malachite green. In the experimentation, the influences of solution pH, adsorbent dosage, extraction time, the type and volume of desorption, desorption time and ionic strength on the performance of adsorption of malachite green in water were investigated. Under the optimized conditions, the response of malachite green showed a good linearity in the range of 0.01～0.3 μg/mL with the correlation coefficient more than 0. 996 3. So the method expected linear range and coefficients of correlation, and it was sensitive and reliable, which was suitable for the determination of malachite green.

magnetic solid phase extraction; UV-vis spectrophotometry; enrichment; malachite green

O657.3；O661.1

A

1009-220X(2016)03-0035-06

10.16560/j.cnki.gzhx.20160311

2016-03-22

祁 嫒（1994~），女，本科；主要从事环境分析方面的研究。251371292@qq.com