桥本甲状腺炎患者外周血滤泡辅助T细胞水平及临床意义

马智鸿，潘凌峰，王 静，包建东

（江苏省原子医学研究所，江苏无锡214063）

桥本甲状腺炎患者外周血滤泡辅助T细胞水平及临床意义

马智鸿，潘凌峰，王 静，包建东

（江苏省原子医学研究所，江苏无锡214063）

目的 检测桥本甲状腺炎（HT）患者外周血滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，Tfh）水平，探讨Tfh与HT发病的关系。方法 采用电化学发光法检测HT患者及对照组外周血FT3、FT4、TSH、甲状腺自身抗体水平，采用流式细胞术分析各组试验对象的外周血Tfh的水平，同时进行相关性分析。结果 与对照组相比，桥本甲状腺炎患者外周血Tfh比例显著升高（P＜0.05）；桥本甲状腺炎患者外周血Tfh与甲状腺自身抗体TPO-Ab呈正相关（P＜0.05），但与Tg-Ab无相关性（P＞0.05）。结果 HT患者外周血中Tfh可能参与桥本甲状腺炎的发生和发展。

桥本甲状腺炎； 滤泡辅助性T细胞； 流式细胞术

桥本甲状腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）又称为慢性淋巴细胞性甲状腺炎，是引起甲状腺功能减退的最常见病因。HT是一种器官特异性自身免疫性疾病。研究表明HT的发病与遗传易感性、环境因素、免疫因素密切相关，但确切的发病原因尚未阐明。以往对HT的细胞免疫学研究多集中在Th1和Th2细胞〛［1］，近年来，研究者发现了一种新的Th细胞亚群，被称为滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，Tfh）。该细胞在次级淋巴器官的生发中心形成、抗体亲和力成熟、B细胞活化、成熟方面均发挥重要作用。研究表明Tfh细胞及其相关细胞因子参与一些自身免疫性疾病的发生发展［2-4］。目前，Tfh细胞与HT的发病机制的研究较少，本实验旨在分析HT患者外周血Tfh细胞的比例及其与HT患者血清中抗甲状腺自身抗体的关系，探讨Tfh细胞在HT发病中的作用。

材料和方法

1 研究对象

所有HT患者均来自江苏省原子医学研究所附属江原医院2013年10月至2014年2月期间门诊及病房，共20例，其中男 2例，女18例，年龄 25～73岁，平均45.3±15.0岁，诊断依据中华医学会内分泌学会制定的《中国甲状腺疾病诊治指南》（2007年版）［5］。所纳入的研究对象均排除其他自身免疫性疾病，感染性疾病及妊娠，未服用任何非甾体类和糖皮质激素类药物。对照组：收集同一时期江原医院体检中心的体检健康者18例，男2例，女16例，年龄20～59岁，平均42.5±12.6岁。两组研究对象间无年龄及性别差异。本研究经江原医院伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

2 试剂及仪器

PerCP-Cy5.5-鼠抗人CD4单克隆抗体、Alexa Fluor647-鼠抗人CXCR5单克隆抗体、PE-鼠抗人ICOS单克隆抗体、流式细胞仪溶血剂（FACS Lysing solution）及FACSCalibur流式细胞仪均为美国BD Biosciences公司产品；E170全自动电化学发光仪、FT3，FT4，TSH，TPO-Ab及Tg-Ab试剂盒均为瑞士Roche公司原装试剂。

3 甲状腺激素、抗甲状腺自身抗体的检测

所有研究对象均于清晨空腹状态下抽取外周静脉血，其中分离胶促凝管采集5 mL，EDTA-K2抗凝管采集2 mL，充分颠倒混匀，标本在6h内测定。分离胶管置37℃温育，待血清析出，3 000 r/min离心5 min收集血清。血清标本用于检测甲状腺激素游离三碘甲腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）、促甲状腺素（TSH）和抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、抗甲状腺球蛋白抗体（Tg-Ab）的含量。EDTAK2抗凝血标本用于流式细胞分析。

4 外周血Tfh细胞的检测

先将试管分为测定组和对照组。将上述采集好的EDTA-K2抗凝血充分混匀后分别吸取50 μL至流式细胞分析管中。在Tfh染色试管中加入PerCPCy5.5-鼠抗人 CD4抗体、Alexa Fluor647-鼠抗人CXCR5抗体、PE-鼠抗人ICOS抗体各10 μL。振荡器上充分混匀，避光室温放置15 min。加入新配制的流式细胞溶血素500 μL，振荡器混匀，避光放置10 min，加入1 mL PBS洗涤1次，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，再加入500 μL PBS充分混匀，上流式细胞仪检测。数据经BD FACSDIVA软件获取和分析。

5 统计学处理

结 果

1 甲状腺激素及甲状腺自身抗体的表达水平

各组研究对象的血清甲状腺激素及甲状腺自身抗体检测结果见表1。

表1 各研究对象甲状腺功能及血清TPO-Ab，Tg-Ab水平

2 外周血不同表型的Tfh细胞比例

Tfh细胞若采用CD4+CXCR5+两种标记作为其表型的话，HT患者（n=20）CD4+CXCR5+T细胞所占CD4+T细胞比例（16.05±3.25）%与健康对照

组比较（n=18）所占比例（15.88±3.81）%比较，差异无统计学意义（t=0.15，P＞0.05）。Tfh细胞若采用CD4+CXCR5+ICOS+三种标记作为其表型，此时HT患者外周血CD4+CXCR5+ICOS+T细胞比例（2.85±1.71）%明显高于健康对照组（1.15± 0.59）%，（t=4.27，P＜0.05）。见图1。

3 CD4+CXCR5+ICOS+T细胞的比例与抗甲状腺自身抗体的相关性分析

对HT患者（n=20）的CD4+CXCR5+ICOS+T细胞比例与抗甲状腺自身抗体（TPO-Ab、Tg-Ab）进行相关性分析，结果显示HT患者组外周血CD4+CXCR5+ICOS+T细胞所占CD4+T细胞比例与其外周血中抗甲状腺自身抗体TPO-Ab呈正相关（r= 0.678，P＜0.05），但与Tg-Ab无相关性（r=0.338，P＞0.05）。

讨 论

CD4+T细胞按照细胞分化和功能可为辅助性T细胞（helper T cell，Th）和调节性T细胞（regulate T cell，Treg）。Th细胞又根据其细胞分化和功能特征分为Th1和Th2两个亚群。Th1主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子，介导细胞免疫反应。Th2细胞分泌IL-4、IL-5、和IL-10等细胞因子，能促进B淋巴细胞的增殖、分化，介导体液免疫。早期的研究认为HT是由Th1细胞介导发生的，然而随着研究的深入，目前认为Tfh细胞才是介导T、B细胞活化的主要细胞。研究显示，Tfh细胞亚群表面持续表达CXCR5，并表达CD40L和ICOS、PD-1等表面分子，BCL-6是其特异性的转录分子［6-7］。淋巴滤泡所产生的趋化因子 CXCL13是CXCR5的特异性配体，表达CXCR5的Tfh细胞在淋巴滤泡产生的CXCL13的趋化下，迁移并定居于淋巴滤泡。Tfh细胞通过其表达的CD40L、ICOS与B细胞上的CD40和 ICOSL结合并相互作用，促进Tfh分泌IL-21，继而作用于B细胞，使B细胞活化并分泌抗体。

HT患者外周血Tfh细胞较对照组显著升高，提示Tfh细胞可能在HT的发病机制中起到了重要作用，其机制可能为：滤泡树突状细胞通过B细胞受体（BCR）将抗原提呈给B细胞，活化的B细胞通过其表达的 ICOSL、CD40、SLAM等与 Tfh相互作用，在滤泡接受Tfh细胞的辅助，分化为浆细胞或者记忆细胞。这些细胞过度表达并作用于甲状腺自身组织时，则产生了针对甲状腺自身组织的抗体，如 TPO-Ab、Tg-Ab等，这些抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和自然杀伤细胞介导的细胞毒作用导致甲状腺细胞破坏，甲状腺组织呈弥漫性淋巴细胞浸润改变。在我们的实验当中，我们分析Tfh细胞时采用了两种表型，分别是CD4+CXCR5+和CD4+CXCR5+ICOS+。我们的实验结果显示当采用CD4+CXCR5+表型时，HT组与对照

组的差异没有统计学意义。但采用CD4+CXCR5+ICOS+时，HT患者外周血Tfh细胞较对照组显著升高。这与姜俊等［8］的结果不太一致，他们当时对49例HT患者进行分析，实验结果显示HT组CD4+CXCR5+比例较对照组高，且差异有统计学意义。造成两种实验结果的差别的可能因素一是试验对象个体因素的差别，不同个体的机体免疫功能不一样。还有一种可能是趋化因子CXCR5并不是Tfh细胞的特异性细胞因子，其他的CD4+T细胞也可一过性表达CXCR5，只有Tfh是持续表达CXCR5，若采用CD4+CXCR5+作为Tfh细胞表型的话，无形中扩大了细胞群体。而Tfh细胞表达ICOS因子可于B细胞表面的ICOSL配体特异性结合，是T、B细胞相互协作时一组重要的信号通道，因此以CD4+CXCR5+ICOS+作为标志可能更能准确反映Tfh的比例。

此外本实验还对Tfh细胞与HT患者体内的TPO-Ab、Tg-Ab抗体做了相关性分析，结果显示HT患者外周血Tfh细胞与TPO-Ab呈正相关（r= 0.678，P＜0.05），但与Tg-Ab无相关性（r=0.338，P＞0.05）。这与Zhu等［9］的研究结果较相符。

以往认为Th2细胞通过分泌IL-4刺激B细胞增殖和Ig类别转换，上调B细胞CD40和MHCII的表达，是辅助B细胞分化、成熟的主要Th细胞。现在则认为Tfh细胞才是辅助B细胞分化、成熟的主要Th细胞亚群，而Th2细胞所分泌的细胞因子在B细胞的活化过程中仅起调节作用。目前有关HT的发病机制与T细胞的关系正成为细胞免疫学研究的热点，一些研究相继报道了Th17细胞及相关细胞因子及Treg细胞及其细胞转录因子在HT患者外周血及甲状腺组织中的异常表达［10-11］。Tfh细胞亚群的发现，进一步拓宽了我们对自身免疫性疾病发病机制的认识。相信随着研究的进一步深入，为我们阐明HT的发病机制，以及在对HT的诊断和治疗方面提供新的思路和方向。

［1］Phenekos C，Vryonidou A，Gritzapis A D，et al.Th1 and Th2 serum cytokine profiles characterize patients with Hashimoto’s thyroiditis（Th1）andGraves’disease（Th2）.Neuroimmunomodulation，2004，11（4）：209-213.

［2］Simpson N，Gatenby P A，Wilson A，et al.Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype thatidentifiesasubsetofseveresystemiclupus erythematosus.Arthritis Rheum，2010，62（1）：234-244.

［3］Ma J，Zhu C，Ma B，et al.Increased frequency of circulating follicular helper T cells in patients with rheumatoid arthritis.Clin Dev Immunol，2012，2012：827480.

［4］Li X Y，Wu Z B，Ding J，et al.Role of the frequency of blood CD4（+）CXCR5（+）CCR6（+）T cells in autoimmunity in patients with Sjögren’s syndrome.Biochem Biophys Res Commun，2012，422（2）：238-244.

［5］中华医学会内分泌学分会《中国甲状腺疾病诊治指南》编写组.中国甲状腺疾病诊治指南—甲状腺炎.中华内科杂志，2008，47（9）：784-788.

［6］冯俊燕，牛俊奇，姜艳芳.滤泡性辅助性T细胞（Tfh）的研究进展.中国免疫学杂志，2010，26（8）：754-757.

［7］金伯泉.T-B细胞协作研究的重大突破—滤泡辅助性T细胞的发现，一个新的CD4+效应T细胞亚群.细胞与分子免疫学杂志，2009，25（1）：1-5.

［8］姜俊，陈宜刚，叶军，等.桥本氏甲状腺炎患者滤泡辅助性T细胞的检测及临床意义.南京医科大学学报（自然科学版），2013，33（12）：1719-1721.

［9］Zhu C，Ma J，Liu Y，et al.Increased frequency of follicular helper T cells in patients with autoimmune thyroid disease.J Clin Endocrinol Metab，2012，97（3）：943-950.

［10］王荣，张健，秦秋，等.Foxp3在自身免疫性甲状腺病患者外周血和病变组织中的表达.西安交通大学学报（医学版），2012，33（1）：56-60.

［11］薛海波，马蕾，王秀云，等.桥本甲状腺炎患者外周血调节性T细胞/Th17细胞平衡动态变化的研究.中华临床医师杂志：电子版，2012，6（8）：2075-2079.

（潘子昂编辑）

The Relationship Between Follicular Helper T Cells in Peripheral Blood and Hashimoto’s Thyroiditis

MA Zhi-hong，PAN Ling-feng，WANG Jing，BAO Jian-dong
（Institute of Jiangsu Nuclear Medicine，Wuxi 214063，China）

Objective To detect the frequencies of circulating follicular helper T cells（Tfh）in peripheral blood of patients with Hashimoto’s thyroiditis（HT），in order to evaluate the relationship between Tfh cells and pathogenesis of HT.Methods The serum levels of thyroid hormone and thyroid autoantibodies（TPOAb，Tg-Ab）were measured by electro-chemiluminescence immunoassay（ECLIA）of both HT patients and normal controls.Frequencies of Tfh cells in peripheral blood were analyzed by flow cytometry，and the relationship with the levels of autoimmune antibody was assessed.Results Tfh cells in Hashimoto’s thyroiditis patients were higher than those in the healthy controls（P＜0.05）.Tfh cells had a positive correlation with TPO-Ab in patients with HT（P＜0.05）.However，there were no relationship between the serum levels of Tg-Ab and the percentage of Tfh cells in HT patients（P＞0.05）.Conclusion Tfh cell may be involved in the onset and development of Hashimoto’s thyroiditis.

Hashimoto’s thyroiditis； Follicular helper T cells； Flow cytometry

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.010

2016-06-13；

2016-07-14