卤虫(AC)n和(AG)n微卫星文库构建

刘海珍, 邹小艳, 郭松长, 李双, 张湑泽, 马建滨*, 都玉蓉*

(1.青海师范大学生命与地理科学学院，青藏高原环境与资源教育部重点实验室，西宁810008；2.中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，西宁810007；3.青海民族大学，西宁810001)



卤虫(AC)n和(AG)n微卫星文库构建

刘海珍1, 邹小艳2, 郭松长2, 李双1, 张湑泽3, 马建滨1*, 都玉蓉1*

(1.青海师范大学生命与地理科学学院，青藏高原环境与资源教育部重点实验室，西宁810008；2.中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，西宁810007；3.青海民族大学，西宁810001)

卤虫Artemia作为重要的基础实验材料和经济动物资源，其微卫星位点具有重要的研究和应用价值。本研究使用磁珠富集法，成功构建了卤虫的(AC)n和(AG)n微卫星富集文库。通过对文库进行PCR方法鉴定和测序确认，所构建的(AC)n和(AG)n文库阳性克隆率分别为55.8%和34.5%。依据得到的微卫星序列，设计并合成了63对微卫星引物，随机以2个地理单元(青海、西藏)共18个卤虫基因组DNA为扩增模板，筛选出6对具有多态性的卤虫微卫星引物。本研究筛选出的微卫星多态位点可用于卤虫种群的遗传多样性评估、遗传图谱的构建和数量性状定位等后续工作。

卤虫；微卫星；富集文库

卤虫属Artemia隶属于甲壳纲Crustasea腮足亚纲Branchiopoda无甲目Anostacea卤虫科Arteidae，是一种适应性极强的小型甲壳动物，广泛分布于全世界内陆盐湖/咸水湖及沿海盐场等高盐水域中。卤虫和卤虫卵具有极高的营养价值，是水产动物苗种生产中十分重要的生物饵料，由于价格昂贵，素有“软黄金”之称。青藏高原地区内陆盐湖/咸水湖棋布，蕴含着丰富的卤虫资源，也被郑绵平院士认为是卤虫生存的重要远景区(郑绵平，2001)。据已公开发表文献，青藏高原上有卤虫分布的盐湖多达20个以上(马志珍，1993；郑绵平，1995；马志珍等, 1996;印象初等，2001)，如尕海盐湖、拉果错盐湖等；而调查显示，仅藏北地区有卤虫繁衍的盐湖就多达34个(http：//www.cags.ac.cn/top/lab/05.htm)。

微卫星DNA(microsatellite DNA)，又称简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)、短串联重复(short tandem repeats, STR)，是广泛分布于真核生物基因组中，以2～6个碱基为核心重复单元组成的DNA序列。与其他分子标记相比，微卫星标记具有数量丰富、多态性高、共显性遗传、重复性好等优点，被广泛应用于保护生物学和遗传育种等领域。

青藏高原是卤虫资源较为丰富的地区。但近年来，肆意捕捞造成卤虫资源量锐减，因而有必要对青藏高原地区尤其是卤虫主产盐湖中卤虫的遗传多样性和遗传分化状况进行评估，为该地区卤虫资源的可持续利用提供科学依据。基于此，本研究采用磁珠富集法，即FIASCO(fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)法(Zaneetal.，2002)构建了卤虫的(AC)n和(AG)n微卫星富集文库并进行微卫星位点的引物筛选，以期为青藏高原卤虫资源的遗传多样性评估、种质资源保护和遗传选育提供分子标记工具。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

主要试剂包括：AFLP接头序列Oligo A和Oligo B，AFLP接头受体特异引物Oligo Mse Ⅰ，MseⅠ限制性内切酶(NEB)，PCR@2.1载体，磁珠Dynal。

本试验合成使用的DNA序列主要有：生物素标记的探针：5’-Biotin-(AG)12-3’；5’-Biotin-(AC)12-3’；未经生物素标记的探针：5’-(AG)12-3’；5’-(AC)12-3’；Oligo A、Oligo B和Oligo Mse Ⅰ的序列：Oligo A，5’-TACTCAGGACTCAT-3’；Oligo B，5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’；Oligo Mse Ⅰ，5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’；M13引物：上游引物，5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’；下游引物，5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。上述DNA序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 实验样品信息表

1.2 基因组DNA提取

选取不同湖泊的卤虫提取基因组DNA(表1)。单只卤虫洗净后剪碎，转移至1.5 mL EP管中，总DNA提取参照《分子克隆实验指南》(Sambrook & Russell，2001)并略作改动。DNA溶液以紫外分光光度计进行浓度与纯度测定，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 微卫星富集文库的构建

参照FIASCO法构建(AC)n和(AG)n富集文库(Zaneetal.，2002)。取4个卤虫基因组DNA等量混合，按照MseⅠ内切酶使用说明构建20 μL酶切体系以获得酶切产物。琼脂糖凝胶电泳检测合格的酶切产物与Oligo A、Oligo B形成的接头在T4连接酶作用下，于16 ℃水浴中连接5 h或4.0 ℃过夜连接。对连接成功的产物以Oligo Mse Ⅰ为引物进行PCR并回收。回收的PCR产物与生物素标记的微卫星探针进行2轮杂交，第一轮杂交温度为60 ℃，第二轮杂交温度为62 ℃，以提高单链微卫星DNA片段的富集效率。富集的单链DNA经PCR扩增恢复为双链并纯化后，将其连接到PCR@2.1载体上，并转化到大肠杆菌Escherichiacoli感受态细胞中，采用蓝白斑实验筛选阳性克隆。

1.4 阳性克隆筛选和测序

挑取白色菌落扩大培养，并以M13 引物和未经生物素标记的探针序列作为混合引物进行菌落PCR，PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，筛选含有2条或2条以上亮带的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司，以M13引物进行双向测序。

1.5 序列校对与引物设计

测序结果经DNAstar(DNAStar Inc.，USA)去除载体序列后，以SSRHunter(李强，万建民，2005)筛选出重复次数大于5的序列，采用Primer Premier 5.0(Premier Biosoft，USA)设计引物并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 结果

2.1 微卫星富集文库构建

琼脂糖凝胶电泳显示，提取的卤虫基因组DNA无明显降解，且分子量大，条带较整齐(图1)，可用于后续实验。基因组DNA经酶切、连接接头、探针杂交后，对杂交片段进行PCR扩增(图2)，图2显示富集成功。然后将富集产物连接到PCR@2.1载体上，并转化至大肠杆菌感受态细胞中，经过蓝白斑筛选，对白斑进行PCR鉴定，如PCR产物显示出2条以上的电泳条带产物(图3)，即表明该菌落为阳性克隆，其中，1、4、5、6、8、9、12条带均扩增出2条DNA产物，初步表明成功构建了青藏高原卤虫的(AC)n和(AG)n微卫星富集文库。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA

M.DNA marker, 1～10.基因组DNA。

M.DNA marker, 1～10.Genomic DNA.

图2 琼脂糖凝胶电泳检测富集片段PCR产物

M.DNA marker, 1.富集片段PCR产物。

M.DNA marker, 1.PCR products of putative microsatellite-containing DNA fragments.

图3 琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR

M.DNA marker, 1～12.菌落PCR产物。

M.DNA marker, 1～12.PCR products of monoclone.

2.2 阳性克隆的测序与引物设计

分别从(AC)n、(AG)n文库中挑取120个和200个白斑菌落进行菌落PCR，分别得到80和120个可能含有微卫星序列的阳性克隆。对上述阳性克隆进行测序，在(AC)n和(AG)n文库中各获得67条和69条含有微卫星的序列，阳性率分别为55.8%和34.5%。图4为含AC和AG重复序列的代表性克隆的测序结果。根据Weber(1990)提出的标准，微卫星的重复类型可分为单一型、间断型和复合型。本研究构建的2个微卫星文库各类型微卫星数目与比例如下：(AC)n文库中，单一型25个，占37.3%；间断型36个，占53.7%；复合型6个，占9.0%；(AG)n文库中，单一型54个，占78.3%；间断型12个，占17.4%；复合型3个，占4.3%。部分微卫星位点的类型、核心序列与侧翼序列如表2所示。

表2 卤虫部分微卫星位点的类型、核心序列及其侧翼序列

注： “…”表示间隔≥3碱基; 下表同。

Note： “…” represents an interval with 3 or more nucleotides; the same below.

在上述序列中，舍弃因侧翼序列过短不宜设计引物以及引物评分过低的微卫星位点，共设计并合成63对微卫星引物。各引物经温度梯度PCR确定最适退火温度后，随机以不同采集地卤虫的基因组DNA为模板进行PCR扩增，筛选出6对多态引物，引物信息见表3。位点L050和L051的扩增产物电泳图谱见图5。

表3 6个多态微卫星位点的引物信息

图4 含有卤虫微卫星序列的阳性克隆

A.AC重复序列, B.AG重复序列。

A.AC repeats, B.AG repeats.

图5 2个微卫星位点的扩增产物多态性检测

A.位点L050, B.位点L051。

A.Locus L050, B.Locus L051.

3 讨论

青藏高原卤虫资源丰富，但其遗传多样性研究较为滞后。微卫星是评估遗传多样性常用的分子标记，本研究采用FIASCO法进行卤虫(AC)n和(AG)n探针微卫星富集文库的构建与鉴定，以期为评估卤虫的遗传多样性、资源保护与选育提供理想标记。

微卫星标记是一种应用广泛的分子标记，但开发具有高效多态性的微卫星引物是一件耗时繁琐的工作。采用传统的微卫星分离方法时，阳性克隆率很低，一般在0.04%～12%，效果较差；使用FIASCO法构建岩原鲤Procypisrabaudi的微卫星富集文库，(AC)n文库的阳性克隆率为7%，(GATA)n阳性克隆率为30%(袁慧等，2008)，效果欠佳。因此，有必要选择一种高效的微卫星分离方法。本研究参照FIASCO法构建了青藏高原卤虫(AC)n、(AG)n富集文库，稍作改动的部分是进行了2次杂交和2次富集，且第二次杂交温度比第一次高2 ℃，从而大大提高了阳性克隆率。经载体连接和克隆转化，本实验获得了较高的阳性克隆率，分别为55.8%和34.5%，也在一定程度说明卤虫的基因组中两碱基的微卫星重复序列较丰富。与构建的藏羚羊Pantholopshodgsoni微卫星富集文库相比(都玉蓉等，2014)，本实验阳性克隆率相对较高，这可能与卤虫基因组中(AC)n和(AG)n微卫星的分布频度有关，也可能缘于实验操作者的熟练程度、操作技能所造成磁珠富集、洗脱效率的差异，进而影响阳性克隆率(Carletonetal.，2002)。

本研究构建了卤虫的(AC)n和(AG)n微卫星富集文库，但仅选取部分菌落进行测序与后续引物设计、扩增验证及多态检测，获得的6对卤虫微卫星引物对卤虫后续的遗传多样性、遗传分化评估及卤虫的遗传选育研究具有一定促进作用。

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Construction of (AC)nand (AG)nMicrosatellite DNA Libraries in Brine ShrimpArtemia

LIU Haizhen1, ZOU Xiaoyan2, GUO Songchang2, LI Shuang1, ZHANG Xuze3, MA Jianbin1*, DU Yurong1*

(1.School of Life and Geography Sciences, Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Environment and Resources, Ministry of Education,Qinghai Normal University, Xining 810008, China; 2.Key Laboratory of Evolution and Adaptation of Plateau Biota,Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810007, China; 3.School of Chemistry and Chemical Engineering, Qinghai University for Nationalities, Xining 810001, China)

Brine shrimpArtemiais an important model organism and economic animal resource.The microsatellite loci of this species have a significant research and application value.In this study, theArtemiamicrosatellite enriched DNA libraries of (AC)nand (AG)nwere conducted successfully using the method of FIASCO (fast isolation by AFLP sequence containing repeats).In the (AC)nlibrary, 67 colonies (total no.120) were picked out and sequenced, with a positive clone rate of 55.8%.In the (AG)nlibrary, 69 colonies out of 200 colonies were sequenced, with a positive clone rate of 34.5%.Among all the sequences containing microsatellites, 63 pairs of primers were designed and synthesized for further primer screening.By using 18ArtemiaDNA samples from Qinghai and Tibetan, 6 pairs of primers with polymorphic microsatellite loci ofArtemiawere identified.These polymorphic loci may facilitate further study on the detection of genetic diversity, genetic linkage mapping and the location of quantitative traits ofArtemia.

Artemia; microsatellite; enriched library

2015-10-13 接受日期：2016-03-24 基金项目：青海省应用基础研究计划项目(2013-Z-750; 2013-Z-751)

刘海珍(1989—), 女, 硕士研究生

*通信作者Corresponding author，E-mail：mjb_117@163.com; xndyr@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20150317

Q959.223; Q78

A

1000-7083(2016)03-0356-05