姜黄素对骨关节炎软骨细胞氧化应激和基质金属蛋白酶13、白细胞介素-6分泌的影响※

宋永周 童九辉 李 明 马 维 关 健 苏瑞红

(河北医科大学第二医院骨科，河北 石家庄 050000)



实 验 研 究

姜黄素对骨关节炎软骨细胞氧化应激和基质金属蛋白酶13、白细胞介素-6分泌的影响※

宋永周 童九辉 李 明 马 维△关 健1苏瑞红1

(河北医科大学第二医院骨科，河北 石家庄 050000)

目的 观察姜黄素对骨关节炎(OA)患者软骨细胞氧化应激和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、白细胞介素-6(IL-6)分泌的影响。方法 无菌分离并体外培养OA患者的膝关节软骨细胞和正常关节软骨细胞；采用姜黄素干预培养细胞24 h，检测各组细胞培养液上清中的MMP-13、IL-6水平，检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性；用Real-Time PCR和Western blot法检测细胞核因子E2相关因子(2Nrf 2) mRNA及其蛋白表达水平。采用荧光共聚焦显微镜观察Nrf 2的核转位情况，分析姜黄素对炎症损伤细胞的干预作用。结果 对关节炎软骨细胞，经姜黄素干预后，SOD、MDA、MMP-13、IL-6均有显著性变化。与正常软骨细胞组比较，关节炎软骨细胞组Nrf 2 mRNA及其蛋白表达水平下调，细胞核内Nrf 2活性增强。经姜黄素干预后关节炎软骨细胞Nrf 2 mRNA及其蛋白表达水平上调，细胞核内Nrf 2活性明显增强。结论 姜黄素能部分纠正关节炎软骨细胞的氧化应激，减轻炎症反应，对软骨细胞具有保护作用。

骨关节炎；中药疗法;姜黄素；基质金属蛋白酶-13；白细胞介素6

骨关节炎是一种慢性关节病，以骨质增生、关节软骨破坏变性为特征[1]。研究表明，骨关节炎的发生及发展与氧化应激关系密切[2]。氧化应激主要是活性氧自由基(reative oxygen species, ROS)产生过多，超出机体清除能力，从而导致组织损伤[3]。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf 2)是调控细胞氧化应激的核心转录因子[4]， Nrf 2通过与胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)及抗氧化反应原件(ARE)相互作用，启动下游解毒酶和抗氧化酶的表达，从而发挥保护作用。姜黄素是一种来源于姜黄的植物多酚，可以抑制细胞炎症反应和氧化损伤[5-6]。同时Nrf 2也是姜黄素作用的重要靶标，激活Nrf 2是姜黄素药理作用的重要分子机制[7-8]。然而，Nrf 2在姜黄素对软骨细胞炎症损伤的保护作用中是否有Nrf 2及其下游信号通路参与，目前尚未见报道。在本研究中，我们利用姜黄素干预体外培养细胞，测定Nrf 2 mRNA及其蛋白表达水平，探讨姜黄素对软骨细胞炎症损伤的保护作用，为姜黄素治疗骨关节炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 选择2014-05—2014-06在河北医科大学第二医院骨科接受膝关节置换的10例骨关节炎患者，平均年龄(64.7±2.6)岁，术中取关节软骨。10例患者临床特征及放射学改变均符合1995年美国风湿病学会(ACR)修订的骨关节炎诊断标准[9]。另选择4例因外伤导致截肢的患者膝关节软骨，平均年龄(39.5±2.0)岁。所有患者排除严重心血管疾病、结缔组织病、内分泌疾病、肝肾疾病及肿瘤疾病。

1.2 主要试剂 姜黄素、二甲基亚砜(DMSO)购自sigma公司；DMEM/F12购自HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA、Ⅱ型胶原蛋白酶为GIBCO公司产品； 胎牛血清(FBS)购自浙江杭州四季青生物工程材料有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；实时定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)试剂盒产自日本Takara公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Nrf 2单克隆抗体购自美国Abcam公司；酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、白细胞介素-6(IL-6)购自Ray Biotech公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG抗体购自美国Jackson Immuno Research公司。

1.3 实验方法

1.3.1 软骨细胞的培养 无菌条件下取大致正常的关节软骨，磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗，剪切成1 mm3的碎块，加入含有DMEM/F12全培养基的0.2%的Ⅱ型胶原酶，消化16 h左右，用200目滤网过滤收集软骨细胞，洗涤细胞，离心后弃上清液，反复3次，细胞与全培养基分散均匀装入细胞培养瓶，置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，每3 d换液，待细胞贴壁生长，分泌基质互相连接成单层时行1∶2比例传代培养[10]。本实验均采用2～3代软骨细胞。采用随机数字表法，分别将炎症软骨细胞(A系)和正常软骨细胞(B系)各分为2组(n=24)，AⅠ组：单纯培养基组；AⅡ组：加入姜黄素组；BⅠ组：单纯培养基组；BⅡ组：加入姜黄素组。

1.3.2 姜黄素刺激软骨细胞 将所培养的软骨细胞以1×107/L、100 μL接种于96孔板中。24 h后待细胞贴壁，吸去培养液，加入姜黄素溶液(80 μmol/L )100 μL/孔，每组6复孔，以不含姜黄素的培养基为对照。继续培养24 h取上清液待测。

1.3.3 上清液SOD、MDA、MMP-13和IL-6测定 检测上述上清液，严格按照试剂盒说明书操作步骤，分别检测上清液中SOD活性、MDA含量、MMP-13和IL-6水平。同条件重复3次实验。

1.3.4 测定Nrf 2 mRNA及其蛋白表达水平 设计目的基因的上游引物为上游5'-TTCCTCTGCTGCCATTAGTCAGTC-3'，下游引物为5'-GCTCTTCCATTTCCGAGTCACTG-3'，扩增产物大小为215 bp。收集培养细胞，抽提总RNA，测定RNA 纯度，并逆转录合成cDNA第1链后进行PCR，用AB 7500型荧光定量PCR仪，β-actin 作为内参基因，扩增程序：94 ℃变性3 min, 94 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃30 s, 循环35次,最后一轮72 ℃延伸10 min，采用2-CT法计算其表达量相对值。

采用Western blot法检测Nrf 2的蛋白表达水平。处理过的软骨细胞用PBS清洗3次，加入预冷的裂解缓冲液，超声处理至组织完全碎裂，14 000 r/min，在4 ℃的冰冻环境下离心收集上清液，BCA法测蛋白浓度。蛋白变性后上样，经蛋白分离及转膜，分别采用封闭一抗和荧光二抗等过程，扫描记录各条带的积分光密度值(IOD)。以β-actin作为内参照。

1.3.5 测定细胞核内Nrf 2活性 姜黄素处理后的各组待测细胞吸取培养基，PBS清洗3次，4%甲醛室温固定，PBS洗涤3次，3%过氧化氢(H2O2)浸泡以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗涤3次，5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)处理5 min，PBS洗涤3次，加入兔抗Nrf 2一抗室温孵育1 h，PBS洗涤3次，FITC标记的山羊抗兔荧光标记的二抗室温孵育2 h，PBS洗涤3次，用4，6-二脒基-2-苯基吲哚染料标记软骨细胞核，PBS避光条件下清洗，荧光共聚焦显微镜下观察，以荧光强度反映软骨细胞核内Nrf 2活性。

1.3.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。多组均数比较采用ANOVA，组间比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组上清液中MMP-13、IL-6、SOD活性及MDA含量比较 见表1。

组 别MMP-13(pg/L)IL-6(pg/L)SOD(U/L)MDA(μmol/L)AⅠ组8411.14±1008.621010.36±118.2343.02±0.7115.27±0.75AⅡ组3425.98±2573.78△720.87±118.34△57.25±1.03△10.68±0.52△BⅠ组1008.58±377.97*△494.83±110.45*△61.14±0.94△9.37±0.41△BⅡ组950.66±188.34456.13±113.8663.12±1.107.73±0.53

与AⅠ组比较，*P<0.05；与AⅡ组比较，△P<0.05

由表1可见，BⅠ组、BⅡ组同为正常软骨，经姜黄素干预后，2组各个检测项目之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。AⅠ组、AⅡ组同为关节炎软骨，经姜黄素干预后，2组4个检测项目比较差异均有统计学意义(P<0.05)。AⅠ组与BⅠ组4个检测项目比较差异均有统计学意义(P<0.05)；AⅡ组SOD活性、MDA含量与BⅠ组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，但MMP-13、IL-6水平与BⅠ组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 4组Nrf 2 mRNA、Nrf 2蛋白表达水平及细胞核内Nrf 2活性比较 见表2。

组 别Nrf2mRNANrf2蛋白表达水平核内Nrf2活性AⅠ组0.37±0.13△0.11±0.12△98±11△AⅡ组1.14±0.17*△0.88±0.14*△167±15*△BⅠ组1.32±0.161.05±0.1567±13BⅡ组1.37±0.171.08±0.1375±12

与AⅠ组比较，*P<0.05；与BⅠ组比较，△P<0.05

由表2可见，与正常软骨细胞组BⅠ组比较，炎症软骨细胞组AⅠ、AⅡ组的Nrf 2 mRNA及其蛋白表达水平下调(P<0.05)；与AⅠ组相比，经姜黄素干预的AⅡ组Nrf 2 mRNA及其蛋白表达水平上调(P<0.05)。姜黄素对正常组干预后，BⅡ组与BⅠ组差异无统计学意义(P>0.05)。 AⅠ、AⅡ组与BⅠ组比较细胞核内Nrf 2活性增强(P<0.05)；与AⅠ组相比， AⅡ组细胞核内Nrf 2活性增强(P<0.05)。

3 讨 论

近年来研究表明，氧化应激学说在骨关节炎的发生发展中起重要作用。由于氧化应激而产生过量的氧自由基，可以损伤软骨基质，抑制蛋白多糖的合成，引起软骨细胞凋亡，从而使软骨细胞大量减少，引发骨关节炎。从姜黄属植物姜黄、莪术、菖蒲等根茎中提取的橙黄色酸性酚类物质为姜黄素，有多种生物活性，包括止痛、散风、活血等。研究表明，姜黄素具有抗动脉粥样硬化、降血脂、抗氧化及抗肿瘤等作用，毒性低，具有良好的临床应用潜力。最近的研究表明，姜黄素可以抑制多种炎症因子的分泌，同时具有抗氧化及抗炎作用，保护软骨细胞，延缓软骨退变[10-12]。

SOD是体内自由基清除剂，其活力的高低反映机体清除氧自由基的能力，MDA是细胞生物膜上的不饱和脂质被氧化后形成的代谢产物，所以培养液中MDA的水平可以间接反映软骨细胞氧化应激损伤的程度[13-15]。本实验结果显示，与正常软骨细胞比较，骨关节炎的软骨细胞MDA含量增多，SOD活性降低，说明骨关节炎与氧化应激关系密切。骨关节炎软骨细胞经过姜黄素干预后SOD的活性明显增加，MDA释放量降低，提示姜黄素通过消除自由基，抑制过氧化反应，可以纠正机体自由基异常代谢，抑制氧自由基引起的细胞和组织的炎症损伤，使软骨细胞退变延缓，对骨关节炎起治疗作用。

软骨细胞外基质以蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白为主，是细胞赖以生成的重要内环境，对维持软骨细胞的生长分化及正常功能有重要作用。基质金属蛋白酶(MMPs)是引起软骨组织细胞外基质降解的主要酶系，其可以降解蛋白聚糖和胶原，消化基质成分，抑制细胞外基质的修复，与骨关节炎关节软骨退行性变有直接而密切的联系。MMP-13又称为胶原酶3，可直接降解软骨基质中Ⅱ型胶原，是最有效的Ⅱ型胶原纤维降解酶[16]。IL-6 能趋化大量炎性细胞进入关节滑液，增强炎症反应，刺激扩大IL-1的炎性作用，抑制蛋白多糖的合成，加重软骨退化，是参与骨关节炎发病进程的重要细胞因子之一[17]。在本研究中，骨关节炎组软骨细胞上清中IL-6 和MMP-13水平均显著增高，提示IL-6和MMP-13均有可能参与骨关节炎的炎症损伤和软骨退变。经姜黄素干预后，均明显下降，提示姜黄素具有强大的抗炎、抗降解作用。

转录因子Nrf 2是调控细胞抗氧化响应基因和诸多由ARE驱动的基因表达的核心分子，也是姜黄素发挥生物效应的重要作用靶标[4，7]。生理状态下，Nrf 2位于细胞质中与Keapl处于结合态，当细胞遭受氧化应激损伤时，Nrf 2与Keapl解离，进而转移入核，与ARE结合，启动下游抗氧化酶的表达[18]。通过检测Nrf 2 mRNA及其蛋白表达，以及其下游抗氧化酶的变化，可提示姜黄素对软骨细胞的保护作用是否有Nrf 2-ARE信号通路的参与。在本研究中， AⅡ组Nrf 2 mRNA、蛋白及SOD的表达均较AⅠ组增高，说明姜黄素对软骨细胞的保护作用有Nrf 2-ARE信号通路参与。

综上所述，由氧自由基引起的氧化应激参与了骨关节炎的发生发展，在骨关节炎患者的软骨细胞中确实存在着氧化应激反应。姜黄素能提高软骨细胞的SOD活性，提高氧自由基清除水平，部分纠正抗氧化应激，有强大的抗炎、抗降解作用，对软骨细胞具有保护作用，其作用机制可能与激活Nrf 2-ARE信号通路有关。

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(本文编辑：董军杰)

Effects of curcumin on oxidative stress and the secretion of MMP-13 and IL-6 of chondrocytes in osteoarthritis patients

SONGYongzhou,TONGJiuhui,LIMing,etal.

DepartmentofOrthopedics,SecondHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Hebei,Shijiazhuang050000

Objective To observe the effects of curcumin on oxidative stress and the secretion of matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) and interleukin-16 (IL-6) of chondrocytes in osteoarthritis (OA) patients. Methods The chondrocytes from articular cartilage with OA and the normal articular cartilage were prepared and cultured in vitro. The chondrocytes were treated by curcumin for 24 h. The contents of MMP-13, IL-6 and malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) were measured in all groups. The nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf 2) mRNA and its protein expression were measured by real-time PCR and Western blot. The nuclear translocation of Nrf 2 was detected by Laser scanning confocal microscopy so as to investigate its intervention on inflammatory injury cells. Results There were significantly changes of SOD, MDA, MMP-13 and IL-16 after intervention of curcumin in OA chondrocytes group. As compared with normal chondrocytes group, the mRNA and protein expression of Nrf 2 in OA chondrocytes group were decreased, and the Nrf 2 activity in the nucleus was enhanced. The mRNA and protein expression of Nrf 2 after intervention in OA chondrocytes group were increased, and the Nrf 2 activity in the nucleus was enhanced. Conclusion The curcumin can partially correct oxidant stress of OA chondrocytes, reduce imflammation reaction, has protective effects of OA chondrocytes.

Osteoarthritis; Traditional Chinese herbs therapy; Curcumin; MMP-13; IL-6

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.09.017

※ 项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：20150666)

R282.710.7；R684.305.31

A

1002-2619(2016)09-1344-05

宋永周(1973—)，男，副教授，博士。从事骨关节退行性疾病的临床研究工作。

2016-05-17)

△ 通讯作者：河北医科大学第二医院骨科，河北 石家庄 050000

1 河北省石家庄市第三医院骨科，河北 石家庄 050011