JNK信号通路活化与BCMA表达对MM细胞的作用研究

徐 光，班永宏，鞠少卿，朱宝立△

(1.江苏省疾病预防控制中心，南京 210028；2.江苏省南通大学附属医院医学检验中心 226001)



·论 著·

JNK信号通路活化与BCMA表达对MM细胞的作用研究

徐 光1，班永宏1，鞠少卿2，朱宝立1△

(1.江苏省疾病预防控制中心，南京 210028；2.江苏省南通大学附属医院医学检验中心 226001)

目的 研究多发性骨髓瘤(MM)细胞中B细胞活化因子(BAFF)及B细胞成熟抗原(BCMA)的表达及作用，JNK信号通路的表达及活化情况，探讨JNK信号通路活化与BCMA表达间的相互作用。方法 采用实时荧光定量(QRT)-聚合酶链式反应(PCR)检测MM患者及健康对照者单核细胞(PBMCs)中BAFF及其受体BCMA、TACI、BAFF-R的表达。采用Western Blot方法检测MM细胞中BCMA蛋白的表达及信号通路蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38及p-p38的表达及活化情况；采用WST-1法检测MM细胞的增殖与存活。结果 MM患者PBMCs中BAFF及BCMA的表达显著高于健康对照者。人BAFF重组体(rhBAFF)促进MM细胞的增殖，Si-BCMA可抑制rhBAFF对MM细胞的增殖作用。除了ERK、JNK及p38的表达外，MM细胞中还有活化蛋白p-JNK的表达。Si-BCMA可下调p-JNK的表达，JNK信号通路抑制剂可下调p-JNK及BCMA的表达。结论 MM细胞中，BAFF通过BCMA促进MM细胞增殖。JNK信号通路活化与BCMA表达相互作用，共同促进MM细胞的增殖与存活。

多发性骨髓瘤； B细胞活化因子； B细胞成熟抗原； JNK信号通路

多发性骨髓瘤(MM)是常见的B细胞恶性肿瘤，以骨髓中异常浆细胞的过度增生、骨损伤及免疫缺陷为特征。尽管近年来MM的治疗取得了显著进步，但其平均5年存活率及10年存活率仅为32%及3%，仍然不可能完全治愈MM。研究证实，细胞因子白细胞介素(IL)-6、IL-10、干扰素(INF)-α、B细胞活化因子(BAFF)等促进MM细胞生长及介导细胞耐药[1-2]，且BAFF的表达影响MM细胞的存活、增殖、转移及耐药[3]。

BAFF是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员之一，属Ⅱ型跨膜蛋白，通过与B细胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)、BAFF受体(BAFF-R)结合来调节B细胞的活化、增生和分泌[4-5]。异常的BAFF表达可调节MM细胞的增殖，表明其受体在促进肿瘤生长的过程中发挥一定作用。有研究报道，BAFF-R是B细胞发生及存活的主要受体，TACI在调节B细胞稳态及自身免疫方面起重要负调控作用，而MM标本中BCMA的持续表达表明BCMA可作为调控恶性浆细胞促存活途径的主要受体。将上述分子作为治疗肿瘤(包括MM)的潜在靶点，极大地引起了研究者们的兴趣。抗BAFF抗体、TACI-Fc及BR3-Fc在自身免疫性疾病和B细胞恶性肿瘤中的作用仍需进一步临床试验评估；同时，破坏BCMA免疫球蛋白Fc段或BCMA抗体也被认为是一种控制恶性肿瘤的治疗策略，但目前仍不可能完全治愈B细胞恶性肿瘤。有研究表明，BAFF与BCMA或TACI结合后，可激活不同信号通路，如NF-κB、p38 MAPK及JNK信号通路。尽管信号通路活化和BCMA表达在细胞存活与增殖中都有重要作用，但在MM细胞中两者是否存在相互作用及其作用机制仍不清楚。

本试验拟研究MM细胞中BCMA表达及JNK信号通路活化情况，初步探讨JNK信号通路与BCMA表达间的相互关系，进一步明确MM细胞发生发展机制，为MM的治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取南通大学附属医院收治的MM患者18例，平均年龄为(60.0±10.0)岁。所有患者均符合MM诊断标准。患者主要特征为骨痛、疲乏、浆细胞浸润、感染和肾功能受损，均排除类风湿关节炎(RA)、中枢神经系统疾病、糖尿病等疾病。健康对照者23例。收集外周血3 mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单核细胞(PBMCs)，-80 ℃保存备用。

1.2 仪器与试剂 采用人重组BAFF(rhBAFF，美国R&D公司)，JNK信号通路特异性抑制剂SP600125(美国Sigma公司)，BAFF抗体、BCMA抗体 (美国R﹠D公司)，兔抗ERK抗体、兔抗磷酸化ERK抗体、兔抗p38抗体、兔抗磷酸化p38 抗体、兔抗JNK 抗体、兔抗磷酸化JNK抗体(美国Cell Signal公司)，β-Actin抗体(美国SANTA CRUZ公司)，TRIzol(Invitrogen公司)，山羊抗兔IgG(H+L)，山羊抗鼠IgG(H+L)，BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)，WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天)。

1.3 细胞培养 采用RPMI1640完全培养基[RPMI1640基础培养基+10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素、链霉素及谷氨酰胺]，37 ℃、5%CO2条件下培养人MM细胞株U266。2周后培养基中需补充1% 200 mmol/L谷氨酰胺。

1.4 荧光定量(QRT)-聚合酶链式反应(PCR) 用TRIzol 法提取细胞总RNA，并用紫外分光光度仪测定总RNA水平。分别取等量RNA以逆转录试剂盒逆转合成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR 扩增。BAFF引物序列：上游引物5′-TGT CAC CGC GGG ACT GAA AAT CT-3′，下游引物5′-TGT CTG CAA TCA GTT GCA AGC AGT-3′；BAFF-R上游引物5′-CTT TCT GGG ACC AGG CTA ACC-3′，下游引物5′-TTC AAG GGC TGT CAA AGA TGG T-3′；BCMA上游引物5′-GCA TCA AGA GCA AAC CGA AGG-3′，下游引物5′-TCT ATC TCC GTA GCA CTC AAA GC-3′；TACI上游引物5′-GCT GAA GCT GAG TGC AGA TCA-3′，下游引物5′-CCC TCT TCT TGA GGA AGC AGG-3′。同时以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照进行扩增。GAPDH上游引物5′-TGC TGT TCT GAC TGG AGT TG-3′，下游引物5′-GCT GTC TTG CTG CCT CAC-3′。反应终体积20 μL中，10 μL SYBR Green Ⅰ mix (Rox)，3 μL cDNA，上下游引物各0.5 μL 。反应条件：95 ℃预变性10 min，随后95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 31 s，重复40个循环。

1.5 WST-1细胞增殖检测 收集对数生长期U266细胞，调节细胞密度，加入96孔板，每孔加入约3 000个细胞，再加入一定体积干预物质，每孔补加培养基至100 μL。每孔加入10 μL WST溶液，培养2 h后，用酶标仪以450 nm(650 nm参考)波长测量各孔的吸光度值。每组设定3个复孔。重复试验3次，取其均值。

1.6 Western Blot 分别提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白水平，根据标准曲线计算出蛋白水平。取50 μg 总蛋白进行150 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并在恒流300 mA下120 min将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜。50 g/L的脱脂奶粉/TBST液封闭。一抗JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、BAFF、BCMA及β-actin抗体4 ℃孵育过夜。加二抗(山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG)，室温孵育2 h，用增强化学发光(ECL) 进行显影。

1.7 细胞转染 转染前1 d，收集对数生长期的细胞，以1×106/mL细胞密度接种于六孔板内，每孔接种2 mL。培养至细胞融合度为70%～80%。BCMA-SiRNA或非特异性SiRNA与转染试剂混合，轻柔混匀，室温放置20 min。将转染混合物以40 nmol/L水平加入到细胞悬液内，前后摇晃孔板，轻轻混匀。细胞于CO2培养箱中37 ℃温育8 h后更换培养基，继续培养48 h，再进行转染后的其他检测步骤。

2 结 果

2.1 BAFF及其受体在MM细胞株及MM患者细胞中的表达 收取MM患者及健康对照者PBMCs提取总RNA及总蛋白，QRT-PCR试验结果，见表1。18例MM患者PBMCs中BAFF、BCMA的表达(1.51±0.24、1.21±0.15)显著高于23例健康对照者(0.74±0.20、0.70±0.08)，Western Blot检测总蛋白结果显示MM患者PBMCs及MM细胞株U266细胞中BCMA的表达显著高于健康对照者，见图1。结果表明MM细胞中BAFF和BCMA均高表达，因此，笔者后续试验着重于两者异常表达对MM细胞的作用及其相互作用。

表1 PBMCs中BAFF及其受体的表达

注：与健康对照者比较，#P<0.05。

注：采用Western Blot，P为MM患者，N为健康对照者。

2.2 BAFF通过BCMA促进MM细胞生长 为进一步明确BAFF及BCMA对MM细胞生长的作用，笔者分别用rhBAFF和BCMA-SiRNA干预后行WST-1细胞增殖试验，结果显示：随着rhBAFF水平的增加(50、 100、200、400 ng/mL)，U266细胞的增殖显著增加，见图2A。不同BCMA-SiRNA转染U266细胞筛选出最有效的SiRNA(即Si-392)用于后续试验，见图2B。rhBAFF和Si-392共同干预U266细胞，WST-1细胞增殖试验结果显示，Si-392可抑制rhBAFF的促增殖作用，见图2C。rhBAFF和Si-392干预后提取总蛋白，Western Blot检测Bcl-2和Bax蛋白表达，结果显示：rhBAFF能上调Bcl-2蛋白的表达，下调Bax蛋白的表达，而Si-392能抑制rhBAFF上述作用，见图2D。结果表明，BAFF通过BCMA促进MM细胞生长，抑制细胞凋亡。

2.3 MM细胞中BAFF及BCMA参与的信号通路 有研究报道，MM细胞中NF-κB通路的活化介导了BAFF促存活、增殖、分化和转移。笔者前期研究发现，rhBAFF可诱导NF-κB活化增加[6]。为研究MM细胞中rhBAFF对MAPK信号通路蛋白表达与活化情况的影响，rhBAFF干预后收集U266细胞提取总蛋白。Western Blot结果显示，随着rhBAFF水平增加，ERK、JNK、p38及活化蛋白p-JNK的表达上调，未见p-p38及p-ERK的表达，见图3A。上述结果表明，MM细胞中有JNK信号通路的活化，且rhBAFF可诱导JNK信号通路的活化。rhBAFF和/或Si-392干预U266细胞后行Western Blot，结果显示rhBAFF可上调p-JNK的表达，Si-392可下调p-JNK的表达，且Si-392可部分抑制rhBAFF对p-JNK的上调作用，如图3B。上述结果表明，BAFF及BCMA均可诱导JNK信号通路的活化，且BAFF诱导JNK活化的作用具有BCMA依赖性。

注：A为WST-1细胞增殖试验检测不同水平rhBAFF对U266细胞增殖的影响；B为QRT-PCR筛选最有效的BCMA沉默基因；C为WST-1细胞增殖试验检测rhBAFF及si-392对U266细胞增殖的影响；D为Western Blot检测rhBAFF及si-392对U266中凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的影响；*P<0.05。

图3 BAFF通过BCMA诱导JNK信号通路的活化

注：A为Western Blot检测不同水平SP600125对p-JNK蛋白表达的影响；B为QRT-PCR检测SP600125对BCMA基因表达的影响；C为Western Blot检测检测SP600125对BCMA蛋白表达的影响；*P<0.05。

2.4 JNK信号通路调节BCMA的表达 不同水平的JNK信号通路抑制剂SP60015(10、20、40、80 μM)作用于U266细胞，48 h后提取总RNA和总蛋白。Western Blot结果显示，随着抑制剂SP60015水平的增加，p-JNK的表达逐渐下降，JNK通路活化显著受抑制，见图4A。QRT-PCR及Western Blot检测BCMA表达，结果均显示，随着抑制剂SP60015水平的增加，BCMA的表达逐渐减低，见图4B、4C。结果表明，JNK通路活化可调节BCMA表达，JNK通路活化与BCMA表达呈正相关。

3 讨 论

MM是骨髓内浆细胞异常增生的一种恶性肿瘤，由于骨髓中有大量异常浆细胞增殖，引起溶骨性破坏，临床主要表现为贫血、骨痛等[7]。尽管初始化疗药物对大多数MM患者有一定疗效，但最后几乎所有患者由于药物耐受而复发。预计从2010年到2030年，MM复发患者将增长57%，故寻找有效治疗措施成为未来医学界的主要奋斗目标[8]。有文献报道，BAFF可调控恶性B细胞的增殖，BAFF及其受体参与了MM的存活、分化与增殖，在MM的病理生理中发挥重要作用。也有研究发现，可溶性BCMA在骨髓瘤患者中高表达，其表达高低与患者疾病进展及预后具有相关性。除此之外，有报道称BCMA可诱导霍奇金淋巴瘤细胞的存活与增殖[9]。上述所有结果表明，BAFF-BCMA轴在B细胞肿瘤的细胞生理中至关重要。

尽管临床前试验及早期临床试验表明，某些单克隆抗体可作为治疗MM的潜在靶点[10-11]，但是否有明确临床效果仍未见报道。故寻求对MM有效的新免疫学疗法依然重要。在前期研究中，笔者发现MM患者PBMCs和U266细胞系中BAFF及BCMA高表达并促进细胞增殖。本研究结果显示，rhBAFF可上调U266细胞的增殖和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，而Si-392沉默BCMA表达后，可抵消rhBAFF的上调作用，结果表明BAFF通过BCMA促进MM细胞的增殖。

BAFF可活化经典及非经典NF-κB通路、JNK信号通路等，上述通路的活化可促进MM细胞的存活与增殖[9,12]。BAFF与BCMA、TACI或BAFF-R的结合可活化经典及非经典NF-κB通路，进而上调抗凋亡蛋白表达，下调凋亡蛋白表达。本研究中，笔者采用U266细胞筛选通路活化蛋白表达，结果显示p-JNK表达即MM细胞中有JNK信号通路活化。随后，笔者经Western Blot验证了JNK信号通路活化对MM细胞增殖的作用及对BCMA表达的影响，即JNK信号通路活化可促进MM细胞增殖，抑制JNK信号通路活化可下调BCMA的表达。笔者以rhBAFF及BCMA的Si-392干预U266细胞后，采用Western Blot检测p-JNK的表达，结果显示rhBAFF上调p-JNK的表达，Si-392可抑制rhBAFF对p-JNK的上调作用。上述结果表明BCMA参与了JNK信号通路的活化，BAFF通过BCMA活化JNK信号通路。由于JNK信号通路活化和BCMA表达都可促进MM细胞的存活与增殖，且彼此相互影响，所以笔者有理由认为，JNK信号通路活化和BCMA表达间可形成正反馈回路，共同促进MM细胞的存活与增殖。

本研究发现，在MM中有JNK信号通路活化和BCMA表达，且JNK信号通路活化可上调BCMA表达，沉默BCMA表达可抑制JNK信号通路活化。JNK信号通路活化和BCMA表达相互影响，共同促进MM细胞的存活与增殖。本研究初步探讨了JNK信号通路、BCMA及MM3者间的关系，揭示了MM细胞中JNK信号通路活化和BCMA表达间存在正反馈回路，为MM的治疗提供了1个新的免疫靶点。

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Interaction between JNK signal pathway activation and BCMA expression collectively promotes the survival of multiple myeloma cells

XUGuang1,BANYonghong1,JUShaoqing2,ZHUBaoli1△

(1.JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing,Jiangsu210028,China; 2.MedicalLaboratoryCenter,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Objective To investigate the expression and role of B-cell activating factor(BAFF) and B-cell maturation antigen(BCMA) in multiple myeloma(MM) cells,expression and activation of JNK signal pathway and to explore the interaction between JNK signal pathway activation and BCMA expression.Methods The expression of BAFF and its receptor BCMA,TACI and BAFF-R in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) of MM patients and healthy controls were detected by the quantitative real-time fluorescence PCR(QRT-PCR).Western blot was adopted to detect the expression of BCMA protein and the expression and activation of signal pathway protein ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38 and p-p38.MM cell proliferation and survival were measured by WST-1 assay.Results The expression of BAFF and BCMA in PBMCs of MM patients was significantly higher than that of healthy controls.Recombinant human BAFF(rhBAFF) promoted the proliferation of MM cells,while Si-BCMA could restrain the proliferative effect of rhBAFF on MM cells.In addition to the expression of ERK,JNK,p38,p-JNK was also expressed in MM cell lines.Si-BCMA could down-regulate the expression of p-JNK,while the JNK pathway inhibitor could down-regulate the expression of p-JNK and BCMA.Conclusion BAFF promotes the proliferation of MM cells via BCMA.The interaction between JNK signal pathway activation and BCMA expression commonly promotes the proliferation and survival of MM cells.

multiple myeloma; B cell-activating factor; B-cell maturation antigen; JNK signal pathway

徐光，女，技师，主要从事免疫方面的研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.009

A

1673-4130(2016)22-3117-04

2016-03-21

2016-06-18)