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双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立

2016-12-08田慧芳徐庆春丁慧荣田志华张宏

分析化学 2016年7期
关键词:多肽质谱

田慧芳+徐庆春+丁慧荣+田志华+张宏+朱华+王昕+沈靖

摘要 建立了双功能试剂2-[(4-异硫氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bn-DOTA)与标准肽段反应的新方法,测定了反应产物与镧系金属Eu的螯合效率,探索了其作为靶向探针和蛋白定量标记试剂性能。考察了不同缓冲体系的浓度及pH值、p-SCN-Bn-DOTA量与肽段相对量、反应体系中有机相与水相比例,反应温度与反应时间对偶联效率的影响。实验结果显示: p-SCN-Bn-DOTA量为肽段的32倍,缓冲体系为0.2 mol/L TEAB (pH 8.5),60℃反应60 min, 有机相与水相之比为4.4∶1(V/V)时标记效率高;在HCl/NaAc缓冲体系(pH 4.0)中60℃反应60 min,金属离子鳌合反应效率高达94%。本研究建立了一种新的基于双功能试剂p-SCN-Bn-DOTA的标记方法,并成功用于RGD肽等的标记。

关键词 双功能试剂; 标记; 多肽; 蛋白定量; 质谱

2015-10-03收稿; 2016-03-11接受本文系北京市自然科学基金(Nos. 7143172, 7143173)资助

E-mail: shenjing69@sina.com

1 引 言

双功能试剂连接多肽并螯合金属元素,可以作为靶向探针结合分子影像技术用于肿瘤的靶向治疗研究[1],还可以通过标记多种金属元素制备蛋白质组学多重定量试剂[2],用于肿瘤标志物的筛选、鉴定、分类等研究。因此双功能试剂在肿瘤研究方面具有良好的应用前景。

RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽,基于靶向多肽RGD进行放射性核素标记可用于αvβ3(+)肿瘤的无创性检查以及判断患者是否适用于抗肿瘤血管形成治疗[3~5]。此外,标记的小分子多肽具有生物相容性好、穿透性强、免疫原性低、作用快、易于实时监测的特点,可在基于靶向探针的蛋白的分析检测方面发挥独特优势[6,7]。

在肿瘤蛋白质组定量分析研究方面,目前已开发的方法有基于稳定同位素标记的方法,如ICAT[8]、18O酶切标记[9]、SILAC[10] 、iTRAQ [11]等,但这些方法普遍存在同位素价格昂贵、标记难度较大、对质谱分析仪器具有选择性、同位素峰在质谱分析时会发生相互干扰等缺点,会给定量结果带来误差[12]。因此探索非同位素标记的方法,开发具有我国自主知识产权的蛋白定量试剂具有重要意义。文献[13~15]报道了针对肽段半胱氨酸标记设计的金属编码亲和标签。徐明等[16]利用外源Hg标签标记硒蛋白/多肽,实现Se-Hg双元素标记选择性识别和检测硒蛋白/多肽。但是在实际的蛋白质组学样本分析中,需要使用适用于所有肽段的标记方法。Liu等[17]开发了基于双功能试剂二乙酸胺五乙酸的标记方法,实现了肽段的无歧视标记,但所选择的双功能试剂标记效率不高。针对此问题,Wang等[18]用羟基琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA-NHS-ester) 作为螯合试剂进行了初步研究,在此基础上,文献[12,19]对标记方法进行了优化,提高了金属标记效率。

虽然非同位素标记的方法已取得了进展,但是仍有以下几方面需要改进。首先,DOTA-NHS-ester 容易水解,在反应体系中,活化酯与NH2的标记反应和水解反应互相竞争,不利于反应体系中水相和有机相组成的确立。其次,肽段中NH2与DOTA-NHS-ester是亲核取代反应,反应体系应在中性或偏碱性条件进行;而DOTA-NHS-ester 在碱性条件下极易水解,水解产生酸,在一定程度上改变反应体系的pH值[20]。因此,DOTA-NHS-ester的水解敏感性高不利于确立标记反应条件,对实际样本分析条件的限制很大,因此优化双功能试剂的意义重大。

2-[(4-异硫氰基苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bn-DOTA)是一种被广泛应用的双功能螯合试剂,如与牛血清白蛋白(BSA)和鸡蛋清溶菌酶标记可用于肿瘤的检测[21],与利妥昔单抗[22]或核糖核酸[23]反应标记可以用于抗肿瘤药的生物分布和显影的研究,还可以与聚乙二醇[24]标记得到胶束用于制剂研发等。它的化学结构较DOTA-NHS-ester稳定,不易发生水解反应,这对于标记反应条件的确立十分有利,并可以通过螯合金属离子标记氨基多肽。基于p-SCN-Bn-DOTA的标记方法的建立不仅有望开发一种新型的金属标记试剂,用于肿瘤蛋白质组学的多重定量分析,而且可将该试剂用于RGD肽的标记,从而有利于肿瘤受体显像剂的开发。本研究建立了基于双功能试剂p-SCN-Bn-DOTA的螯合金属元素标记多肽新技术,并成功标记RGD等标准肽段。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Ultraflex II基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS,德国布鲁克公司);Discovery DV215CD分析天平(美国OHAUS公司);HQ-60涡旋混匀器(北方同正生物技术发展有限公司);PMC-060掌上离心机(日本TOMY公司)。

α-氰基-4-羟基肉桂酸(德国布鲁克公司);标准合成肽段 LGEYGFQNALIVR由吉尔生化(上海)有限公司合成;RGD肽由北京中海康医药科技发展有限公司合成;三乙二胺碳酸盐(TEAB)、氯化铕(EuCl3)(美国Sigma-Aldrich公司);p-SCN-Bn-DOTA(美国 Macrocyclics 公司);其它试剂均为国产分析纯;实验用水为Milli-Q(美国Millipore公司)超纯水。

2.2 实验方法

2.2.1 p-SCN-Bn-DOTA与标准肽段的偶联反应 100 μL 0.5 μmoL p-SCN-Bn-DOTA溶于二甲基甲酰胺(DMF), 50 μL 0.68 μmoL肽段LGEYGFQNALIVR溶于TEAB。将两种溶液以不同比例混合进行偶联反应,考察TEAB的浓度和pH值、DOTA与肽段的摩尔比、反应温度、反应时间等条件对偶联效率的影响。其中肽段的终浓度始终为0.05 nmol/μL。称取RGD肽 1 mg, 加DMF 124 μL,供p-SCN-Bn-DOTA与RGD肽的偶联反应。

2.2.2 偶联产物与金属离子的螯合反应

向2.2.1中的反应体系加入5 μL 0.1 mol/L EuCl3溶液(盐酸-乙酸钠缓冲液或乙酸-乙酸铵缓冲液),再分别加入相应的不同pH值的缓冲液50 μL,考察pH值、反应温度、反应时间对螯合效率的影响。

2.2.3 MALDI-TOF-MS分析 (1)干点法点样 取1 μL分析样品点于Ground steel靶板上,自然干燥后,再点5 mg/mL CHCA基质溶液(0.1%TFA-50%乙腈溶液)1 μL,自然干燥后进行质谱分析。(2)薄层法点样 先在靶板上点0.5 μL CHCA基质的乙醇过饱和溶液,自然干燥后,再点1 μL CHCA基质溶液(5 mg/mL,0.1% TFA-50% 乙腈溶液)和样品的混合溶液。采用Peptide Calib standard mono 作为标准品校正,相对标准偏差≤5 ppm。质谱数据采集采用反射模式。仪器控制软件为FlexControl software verion 3.0,数据处理软件为FlexAnalysis software verion 3.0。

3 结果与讨论

3.1 双功能试剂的选择

目前针对巯基的金属元素标记方法较多,标记氨基的金属元素标记方法研究较少,已有的标记N-端氨基的方法有转氨法等,如先将蛋白的游离N-端氨基转化为活性的羰基,然后与连有肼的荧光基团反应得到标记分子[25] 。氨基的金属标记,理论上可以标记所有的肽段,对所有的肽段和蛋白质(含巯基和不含巯基的)都能进行定量研究[2,20,26,27]。p-SCN-Bn-DOTA是一种双功能螯合试剂,可与肽段的氨基共价结合,并通过络合反应螯合金属离子,与Wang等[18]采用的DOTA-NHS-ester相比,其结构稳定,不易水解,既能够明确反应体系中水相和有机相的比例,又有利于确定反应体系的pH值,这些均利于标记反应条件的确立。

3.2 金属元素和标准肽段的选择

p-SCN-Bn-DOTA可与多种稀土金属离子形成螯合物,其中与镧系金属离子形成的螯合物稳定性最佳[28],故选镧系金属离子Eu作为螯合标签。

标准肽段的选择应具有典型性,由于实际的生物样本大多是通过胰酶酶解成肽段,肽段C端是精氨酸(R)或者赖氨酸(K),故选用常用的标准蛋白牛血清白蛋白的胰酶酶解肽段LGEYGFQNALIVR作为标准肽段之一;RGD肽由于在肿瘤诊断和治疗中的重要意义而被选作为标准肽段。

3.3 肽段的金属元素标记反应原理

肽段的金属元素标记反应的原理如图1所示,首先是肽段的氨基与p-SCN-Bn-DOTA发生共价反应,反应产物再与镧系金属元素形成稳定螯合物。

以产物和反应物的MALDI-TOF-MS质谱峰峰面积计算标记反应的效率,标记效率(%)= 产物峰面积/(产物峰面积+原肽峰面积)×100%。

3.4 p-SCN-Bn-DOTA与标准肽段偶联反应的优化

3.4.1 缓冲体系对p-SCN-Bn-DOTA标记反应的影响 考察了3种缓冲体系NaHCO3-Na2CO3体系、DMF-三乙胺体系以及三乙二胺TEAB体系。对于0.5 mol/L NaHCO3-Na2CO3缓冲液(pH 8.8),由于反应产物盐浓度过高,需要稀释50倍以上才能被MALDI-TOF检测到,而且钠盐是不可挥发性盐,Na+对质谱可能产生的干扰不易去除。Scheinberg等[29]将p-SCN-Bn-DOTA与肽段GGGFC在无水的DMF -三乙胺体系中反应,但是实际的生物样品酶解产物是含水的体系,因此纯有机溶剂的DMF-三乙胺体系不适用于生物样品酶解产物分析。而TEAB是可挥发性碳酸盐,p-SCN-Bn-DOTA与肽段LGEYGFQNALIVR(m/z 1479)可以在TEAB缓冲体系中反应生成标记产物(m/z 2031),而且结晶状态好,适合质谱检测,因此, 选择TEAB体系进行后续实验条件优化。

3.4.2 p-SCN-Bn-DOTA的量与肽段量的比例、反应温度、反应时间对标记反应的影响 由于标记反应中影响标记效率的因素众多[30,31],本研究考察了p-SCN-Bn-DOTA量与肽段量的比例、反应温度、反应时间等因素,结果如表1所示。由表1可见,p-SCN-Bn-DOTA和肽段的摩尔比为32倍,在60℃反应60 min时,标记效率最高,因此选择上述条件为最佳反应条件。与文献[20]报道的DOTA-NHS-ester 50倍过量于肽段、肽段的终浓度为0.125 nmol/μL相比,本方法反应试剂的用量少,而且适用的肽段的浓度更低,显示出更高的标记灵敏度。肽段和标记产物的质谱图如图2所示。

3.4.3 反应体系中有机相与水相比例的考察 实验条件优化过程中,为保证肽段的终浓度一致,需要改变有机相和水相的比例来实现其它参数的调整。实验过程中发现,在一定范围内,反应体系中水的比例越高,标记效率越低, 最佳有机相与水相之比为4∶1~5∶1(V/V)。

3.4.4 缓冲体系浓度及pH值对反应的影响 缓冲体系浓度及pH值是影响螯合剂配位能力的主要因素。本研究考察了0.1, 0.2和0.5 mol/L TEAB缓冲溶液在pH值分别为6.5,7.5,8.5,9.5 时DOTA与肽段的偶联效率,用三乙胺和冰醋酸调节pH值。结果表明,缓冲体系为0.2 mol/L TEAB, pH 8.5的条件下偶联效率较高,且重现性好。

3.5 p-SCN-Bn-DOTA与RGD肽的偶联反应

按照2.2.1节实验方法制备RGD肽,在优化的条件下,即缓冲体系为0.2 mol/L TEAB(pH 8.5),与p-SCN-Bn-DOTA在60℃进行偶联反应60 min, 实验结果如图3所示,标记效率为90.6%。

3.6 反应温度、反应时间及pH值对螯合反应的影响

对于EuCl3与DOTA 偶联产物的标记反应,分别考察了乙酸铵-乙酸(HAc-NH4Ac),盐酸-乙酸钠(HCl-NaAC)反应体系;反应温度为30℃,60℃和100℃;反应时间为15和60 min;pH值为4.0和5.5时的标记效率。结果如表3及图4所示, 其中在pH 4.0 的HCl-NaAC缓冲液中,60℃反应60 min标记效率最高,而且酸性条件下(pH 4.0),可以减少金属离子和肽段的非特异性结合。

3.7 MALDI检测方法的考察

对用于MALDI检测的样品点样方法进行了考察,比较了干点法和薄层法两种方法。如图5所示,结果显示干点法相对较好,结晶状态均匀,样品检测灵敏度高。

4 结 论

本研究通过双功能试剂p-SCN-Bn-DOTA与RGD等标准肽段反应,考察与镧系金属元素Eu 螯合效率,对螯合稀土金属标记肽段的反应条件进行了优化。p-SCN-Bn-DOTA与标准肽段反应的条件为:DOTA 为肽段的32倍,缓冲体系为0.2 mol/L TEAB,pH 8.5,反应温度60℃,反应时间为60 min; 偶联产物与金属离子反应的条件为:pH 4.0的HCl/NaAC缓冲体系中反应60 min。MALDI-TOF检测时样品点样方法使用干点法较好。本研究结果表明, p-SCN-Bn-DOTA在标记RGD等多肽上有良好的应用,有望成为一种新的高灵敏度金属标记试剂和肿瘤受体显像剂。

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Abstract A novel labeling approach with good compatibility based on 2-(4-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (p-SCN-Bn-DOTA) was established. The labeling conditions of p-SCN-Bn-DOTA with standard peptides were optimized, and the labeling efficiency of macrocyclic complex of p-SCN-Bn-DOTA with lanthanide metal ion Eu was also investigated. The labeling process was a two-step reaction. The labeling efficiency was affected by several factors including pH, buffer, reaction time, reaction temperature, and ratio of p-SCN-Bn-DOTA to peptide. The optimized conditions were as followed: the first step of labeling reaction was reacted in 0.2 mol/L triethylene diamine (TEAB) (pH 8.5) buffer for 60 min at 60℃, and the molar ratio of p-SCN-Bn-DOTA with peptide was 32. The second step of rare earth metal chelating was in pH 4.0 HCl/NaAC buffer for 60 min at 60℃. This approach was successfully applied in RGD peptide labeling.

Keywords Bifunctional chelating reagents; Labeling; Peptide; Protein quantification; Mass spectrometry

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