玉米ZmREM基因的克隆与逆境胁迫后表达分析

瓮巧云，赵彦敏，张 贺，宋晋辉，马海莲，袁进成，刘颖慧，*

(1.河北北方学院 农林科技学院，河北 张家口 075000； 2.张家口市广播电视大学，河北 张家口 075000)



玉米ZmREM基因的克隆与逆境胁迫后表达分析

瓮巧云1，赵彦敏2，张 贺1，宋晋辉1，马海莲1，袁进成1，刘颖慧1，*

(1.河北北方学院 农林科技学院，河北 张家口 075000； 2.张家口市广播电视大学，河北 张家口 075000)

B3超家族基因是植物中特有的一类转录因子，参与植物生长发育、形态建成及抗逆境胁迫等过程。从玉米黄早4中获得一个含有2个B3-DNA结合域的基因，为B3超家族基因，命名为ZmREM。该基因全长1047bp，编码含有349个氨基酸的蛋白。Blast比对结果表明，ZmREM和谷子含有B3结构域蛋白、高粱的假定蛋白相似性分别为81%和84%。ZmREM基因是组成型表达，在根中表达量最高。同时ZmREM基因的转录水平可以为干旱、盐、冷和热所诱导。因此，ZmREM可能参与玉米多种非生物胁迫应答途径。

玉米；REM转录因子；基因克隆；非生物胁迫

B3超家族基因广泛存在于拟南芥、水稻、番茄、玉米等多种植物，是植物中特有的一类转录因子[1-5]。该超家族基因根据蛋白结构域和功能的特征可分为5个家族，包括ABI3-VP1、ARF(生长素响应因子)、HSI (high-level expression of sugar-inducible)、RAV (related to ABI3-VP1)、REM (reproductive meristem)[6]。研究表明，B3超家族基因在植物生长发育和形态建成、逆境胁迫过程中发挥着重要的作用。如：拟南芥ARF家族基因，在盐胁迫条件下大多数ARF基因表达量下调；ARF2参与乙烯信号传导途径；ARF5和ARF7调控细胞分化；ARF7和ARF9还参与生长的信号传导途径，影响着植物侧根的形成；拟南芥过量表达ABI3基因增加了At2S3、AtCRC、AtEM1、AtSOM和AtEM6的表达量，35S∶ABI3转基因种子对 ABA 更加敏感[6]；拟南芥abi3-5种子对脱落酸敏感，在种子萌发期表型显著；辣椒中RAVI转录因子CARAV1受到病原菌、ABA等植物激素和非生物胁迫的诱导，表达量上调。过表达CARAV1后激活了转基因拟南芥株系中PR相关基因的表达，并且提高了植株对病原菌的抗性及其对高盐、渗透胁迫的抗性等[7-13]。

莫晓婷等[3]通过生物信息学方法已经明确了玉米中含有49个B3超家族基因。ZmRAV1是目前玉米中唯一一个明确功能的B3超家族基因，在干旱、盐和脱落酸胁迫下，ZmRAV1基因表达量增加；同时，过量表达ZmRAV1的拟南芥经盐和渗透胁迫后，在萌芽率、根长度、电解质透出率等方面与野生型有明显的区别。鉴于植物B3超家族基因在逆境胁迫应答过程具有重要作用，本试验以玉米为材料，以期克隆获得玉米B3超家族基因。分析玉米不同组织中，各种非生物胁迫后B3超家族基因表达变化，明确其与玉米抗逆胁迫的关系，以期进一步了解玉米抗逆胁迫机制，并通过基因转化技术获得抗逆转基因玉米新种质，为玉米抗逆分子育种服务。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

以玉米自交系黄早4为供试材料，种植于河北北方学院农场，采用正常田间管理模式。分别取3棵植株的根、茎、叶、花丝、籽粒，液氮速冻后于-80℃保存备用。

取三叶期的玉米植株用于非生物胁迫处理，在光照培养箱中培养，培养条件为25℃，14h光照/10h黑暗。非生物胁迫处理包括NaCl处理(浓度为250mmol·L-1)、干旱处理(20%聚乙二醇PEG溶液)、低温(4℃)和高温(42℃)处理。处理后分别于0、1、3、6、12和24h取样，液氮速冻-80℃保存备用。以未处理玉米植株为对照，每个处理重复3次。

1.2 总RNA提取和反转录

按照植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明提取玉米植株总RNA。根据FastQuant RT Kit(With gDNase)说明反转录合成第一链cDNA(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 基因的克隆

根据TAIR(TheArabidopsisInformation Resource)网站上提供的拟南芥AtREM基因(AT4G31610)，设计扩增ZmREM基因的引物。引物序列为F:5′-ATGGCTACGGTGTCCTC-3′，R:5′-CTAAAACTGCTCCCTGCGAA TG-3′ 。以合成的第一链 cDNA 为模板，利用 pfuTaqmix(天根生化科技(北京)有限公司)扩增目的基因。扩增体系包括 20μL pfuTaqmix，2μL cDNA，正向引物和反向引物各 1μL(10μmol·L-1)，补水至50μL。扩增条件为94℃，10min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃，10min；4℃保存。利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。将目的条带进行回收，由华大基因进行测序。

1.4 生物信息学分析

利用NCBI网站的BLAST工具与GenBank已知物种基因进行比对分析；利用Conserved Domain Search Service(CD Search)软件搜索基因的保守结构域；利用在线软件Prot Scale (http://web.expasy.org/protscale)预测目的蛋白氨基酸序列的疏水性/亲水性；利用SWISS-MODEL在线工具(http://swissmodel.expasy.org/interactive)进行三维结构预测，并利用可视化工具Swiss-PdbViewer进行查看。

1.5 ZmREM基因实时荧光定量PCR分析

利用实时荧光定量PCR技术，分析各种非生物胁迫后基因表达变化情况。设计引物为：正义：5′-TGTATCAATAATGCGGAGGG-3′和反义：5′-CAAAGTCTAACCACTCTCCC-3′。利用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits及Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)试剂于荧光定量 PCR仪(Agilent 3000P)上进行PCR扩增。20μL反应体系中包括 10μL 2×SYBR Green 1，1μL cDNA(稀释后)，正向引物和反向引物各 0.5μL (10μmol·L-1)，8μL ddH2O。扩增程序为 95℃ 5min预变性，30个扩增循环(95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)；72℃，10min，每个样品设 3次重复。利用MxPro-Mx3000P软件和Excel软件分析、处理数据。

2 结果与分析

2.1 ZmREM基因的克隆和特性分析

本研究根据拟南芥AtREM基因(AT4G31610)设计引物，以玉米反转录合成第一链cDNA为模板，扩增获得一条单一条带。获得的玉米cDNA序列经与Maize GDB数据库比对，结果显示该基因为一个新基因，目前还没有研究报道。CD Search分析发现该序列含有2个B3-DNA结合域，属于REM基因，故将该基因命名为ZmREM(图1)。ZmREM基因全长 1047bp，编码含有349个氨基酸的蛋白(图2-A)。该蛋白富含甘氨酸、缬氨酸和精氨酸等，其分子量和等电点分别为 38.86ku和8.64。将ZmREM与GenBank中已知基因进行BLAST比对。结果表明，该基因与高粱假定蛋白同源性为84%；与谷子含有B3结构域蛋白同源性为81%。

Prot Scale预测ZmREM蛋白氨基酸序列的疏水性/亲水性如图2-C所示。根据氨基酸分值越低亲水性越强，分值越高疏水性越强的规律，可以看出，多肽链第25位具有最高的分值2.111和最强的疏水性; 第99位具有最低的分值-2.567和最强的亲水性。ZmREM大部分氨基酸具有疏水性，推测该蛋白属于疏水性蛋白。利用SWISS-MODLE蛋白质数据库对获得的ZmREM蛋白进行保守位点和蛋白质结构预测。结果表明，该蛋白含有7个折叠和4个螺旋，其三维结构显示ZmREM主要为螺旋—折叠—螺旋的结构(图2-B)。

2.2 玉米不同组织中ZmREM基因表达分析

以孕穗期玉米植株的根、茎、叶、花丝、籽粒为材料，利用实时荧光定量PCR技术分析ZmREM基因在不同组织中的表达情况。结果表明，ZmREM基因是组成型表达，在各组织中均检测到ZmREM基因的表达。其中根的表达量最高，其次依次是叶、籽粒、茎、花丝(图3)。ZmREM在玉米不同组织中的差异表达，可能和其功能不同相关。

图1 玉米ZmREM蛋白功能域预测Fig.1 Domains prediction of ZmREM protein

A, PCR扩增结果; B, 蛋白的三维结构图;C, 蛋白疏水性/亲水性预测A, PCR result; B, The three-dimensional structures of ZmREM; C, Predication of hydrophobicity/hydropholicity

图3 玉米不同组织中ZmREM基因表达分析Fig.3 Expression analysis of ZmREM in different tissues of maize

2.3 非生物胁迫后ZmREM基因的表达分析

对三叶期玉米植株分别进行PEG、NaCl、4℃和42℃胁迫处理，利用实时荧光PCR技术分析了不同非生物胁迫后ZmREM基因的表达情况。结果表明，ZmREM基因的表达受PEG、NaCl、4℃和42℃胁迫后诱导上调表达，且不同处理后基因的表达变化趋势不同(图4)。PEG和42℃处理后ZmREM表达量变化均表现为随着处理时间的延长表达量逐渐升高的趋势，于24h时表达量最高。冷胁迫处理后ZmREM表达量变化表现为先升高后降低。处理后0～12h随着处理时间的延长，ZmREM表达量持续上升并于12h达到最高值，12h后表达量开始下降。NaCl胁迫处理后，ZmREM表达量呈现下降的趋势。由此可见，ZmREM基因受PEG、NaCl、4℃和42℃胁迫后诱导表达，在玉米应答胁迫反应中可能起重要作用。

A，PEG处理；B，42℃处理；C，4℃处理；D，NaCl处理A，PEG; B，42℃;C，4℃; D，NaCl

3 讨论

REM家族基因是一类含有B3功能域转录因子，该家族不同成员之间含有 B3功能域的数量存在较大差异。花椰菜BoREM1是植物中最先分离获得的REM基因，该基因在生殖分生组织表达[14]。AtREM1是BoREM1同源基因，含有3个B3功能域。AtREM1在拟南芥生殖分生组织中表达，参与花的发育过程[15-16]。拟南芥VRN1(Reduced Vernalization Response 1)，含有2个B3功能域。该基因在各个组织中大量表达，通过与DNA进行结合来维持植物的春化作用[17-19]。Matias-Hernandez等[20]明确了拟南芥VDD(Verdandi/REM20)基因影响种子发育过程中的胚囊分化；Otho等[21]发现REM22、REM23、REM24和REM25在拟南芥花发育各阶段表达。目前，关于其他物种REM基因尤其是玉米REM基因还没有进行深入研究，它们在植物逆境胁迫过程中的作用还有待研究。本研究从玉米中获得了一个含有2个B3功能域，属于REM家族基因。通过实时荧光定量PCR技术，明确了该基因为组成型表达。同时该基因的转录水平受到干旱、盐、冷和热胁迫等的诱导表达。因此，我们推测ZmREM可能参与玉米多种胁迫应答途径。然而关于ZmREM基因功能以及对胁迫信号如何精确应答，还需要继续深入研究。

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(责任编辑 张 韵)

国家重点研发计划“长江中下游水稻化学肥料和农药减施增效综合技术集成研究与示范”项目正式立项

该项目由浙江省农科院牵头，联合中国水稻所、全国农技中心、长江中下游六省一市农科院、涉农高校、农技推广部门以及有关企业等24家单位共同承担。根据项目目标和区域内不同生态和种植制度特点下设9个课题。

项目主要通过水稻品种的筛选与合理布局、化肥减量减损增效和养分替代、病虫害非化学防治、精准高效农药使用、肥药协同增效等技术的突破，结合现有成熟技术，集成创新不同种植制度下的综合技术模式，并应用效果评价来调整和完善技术。通过管理机制创新，集成科研、推广、农资生产经销者、农业经营主体和政府多元协同的示范推广体系,同时建设信息化平台和扶持商业化专业服务组织，实现新技术的快速传播与应用、提升技术推广应用效果。与农业部已经设立的示范区紧密结合，建立核心示范区，开展更大范围的技术示范和辐射带动。

通过研究将形成适合长江中下游稻区不同生态区水稻化肥农药减施增效技术模式，并建立相应技术规程。通过基地示范、新型经营主体和现代职业农民培训，可减少化肥农药不合理施用带来的农产品质量安全和环境污染风险，为保障生态环境安全和农产品质量安全，推动“供给侧”改革和农业发展“转方式、调结构”，促进农业可持续发展提供强有力的科技支撑。

经过五年努力，在本稻区示范推广1000万亩，实现示范区内的肥料利用率提高8个百分点、化肥减量施用17%，化学农药利用率提高11个百分点、农药减量施用30%。

Cloning of ZmREM and its expression analysis in maize under stress

WENG Qiao-yun1，ZHAO Yan-min2，ZHANG He1，SONG Jin-hui1，MA Hai-lian1，YUAN Jin-cheng1，LIU Ying-hui1，*

(1.CollegeofAgricultureandForestry，HebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China; 2.ZhangjiakouRadio&TVUniversity，Zhangjiakou075000，China)

The plant-specific B3superfamily constituted a large transcription factor superfamily.They play central roles in plant development，morphogenesis and stress-resistance.Taking total RNA of maize as template，REM gene was cloned by use the method of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Length of 1047bp cDNA sequence that encoding 349amino acids was obtained.CD search result showed that it contained two B3-DNA domains and was named asZmREM.Blast result indicated thatZmREMhad 84% and 81% homology withSorghumbicolorhypothetical protein andSetariaitalicaB3domain-containing protein.In various tissues，gene expression in root was the highest.The expression ofZmREMin maize was induced by heat，high-salt，cold and PEG treatment.These results suggested thatZmREMmight be a stress related gene of maize.

maize (ZeamaysL.); REM transcription factor; gene cloning; abiotic stress

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.11.03

2016-03-31

国家自然科学基金(31101155)；河北北方学院重大项目(ZD201407，ZD201305)；河北省科技厅项目(13226326)

瓮巧云(1979—)，女，河北定州人，博士，副教授，从事植物抗逆机制研究。E-mail: nkxwqy@163.com

*通信作者，刘颖慧，E-mail: leely519@126.com

S513

A

1004-1524(2016)11-1822-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis，2016，28(11): 1822-1827

http://www.zjnyxb.cn

瓮巧云，赵彦敏，张贺，等.玉米ZmREM基因的克隆与逆境胁迫后表达分析[J].浙江农业学报，2016，28(11)： 1822-1827.