不同方法测定壳聚糖脱乙酰度的比较

纪建华

（汉中职业技术学院，药学与医学技术系，陕西汉中723000）

分析测试

不同方法测定壳聚糖脱乙酰度的比较

纪建华

（汉中职业技术学院，药学与医学技术系，陕西汉中723000）

以1H核磁共振波谱法测定结果为参考，评价差示扫描量热法与电位滴定法测定壳聚糖脱乙酰度的准确度。试验结果表明，差示扫描量热法测定结果与1H核磁共振波谱法更为接近，且标准偏差小于1.5%，表现出较好的准确度和精密度。另外在不同时段和日间的测定结果也较为一致，具有较好的稳定性和重现性。与电位滴定法相比，差示扫描量热法操作简便、快速，直接测定固体样品，无需预处理样品和配置、标定、储存标准溶液，从而可满足相关工业快速检测要求。

壳聚糖；脱乙酰度；差示扫描量热法；电位滴定法；方法比较

壳聚糖是甲壳素氨基上部分脱除乙酰基的产物，由2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖（GlcNAc）与2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖通过β-1,4糖苷键共聚构成（GlcN），见图1。

图1　壳聚糖化学结构Fig.1Chemical structure of chitosan

因其来源丰富且安全、无毒、可生物降解，从而被广泛用于医药、化工、纺织等行业[1]。壳聚糖脱乙酰度（Degree ofdeacetylation,DD%）是壳聚糖分子氨基上脱去乙酰基的百分比，高低程度直接影响粘度、膜张力、螯合系数及免疫活性等物理、化学和生物学性质[2]。

目前，测定壳聚糖脱乙酰度的方法有：酸碱滴定法[3]、电位滴定法[4]及1H核磁共振波谱法（1H NMR）[5]等，其中1H NMR法被美国标准测试组织认定为测定壳聚糖脱乙酰度标准分析方法[6]，但由于分析时间较长且仪器装置较为昂贵，限制了广泛应用。差示扫描量热法（DSC）具有操作简便，分析时间短，可直接用于固体样品测定的特点，而被用于壳聚糖脱乙酰度的测定[7]，电位滴定法则作为国内行业仲裁方法，在实验室分析中大量应用[3]。本研究以1H NMR测定结果为参考，评价差示扫描量热法与电位滴定法测定结果的准确度。试验结果表明：与电位滴定法相比，差示扫描量热法测定结果与1HNMR更为接近，具有较好的准确度，且操作简便、快速，直接测定固体样品，无需预处理样品和配置、标定、储存标准溶液，从而可满足相关工业快速检测要求。

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

STA449F3型DSC/TGA同步热分析仪（德国耐驰）；Varian Inova-600核磁共振波谱仪；微孔滤膜（天津津腾）；FA1204B电子天平（上海精科）；CJJ-781型磁力搅拌器；DZF型真空干燥箱；Scientz-50ND型冷冻干燥机；雷磁pHS-3D型酸度计；雷磁E-201-C型pH复合玻璃电极

壳聚糖（山东丰泰生物科技有限公司）；D2O与DCl（阿拉丁试剂）；其余所用试剂皆为分析纯，试验用水为蒸馏水。

1.2试验方法

1.2.1样品制备称取10.0g壳聚糖样品，搅拌完全溶解于600mL0.5mol·L-1醋酸溶液中，通过0.45μm滤膜过滤后，往滤液中滴加1.5mol·L-1NaOH溶液至壳聚糖沉淀完全析出，依次使用蒸馏水与无水乙醇将其洗至中性，冷冻干燥取出，研磨均匀，通过100目筛过滤，放入真空干燥箱105℃下干燥6h后，放置于干燥器中保存备用[8]。

1.2.21H NMR法称取壳聚糖0.003g，加入至3mL D2O中，另加入1mol·L-1DCl 250μL，完全溶解后，放置于核磁共振波谱仪内，实验条件：质子光谱宽度：10，扫描数：8，弛豫延迟：15s，脉冲角：90°，采样时间：2min，采样点数：3.2×104，记录1H NMR图谱[5]，按照下式计算壳聚糖脱乙酰度。

式中H-AC：共聚结构单元2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖中乙酰基的3个氢原子峰面积；H-2/6：基本结构单元2,5-缩水甘露糖中6个氢原子峰面积；DD%：壳聚糖脱乙酰度。

1.2.3差示扫描量热法称取0.005g壳聚糖样品，置于刚玉坩埚中，在流速50～100mL·min-1的N2氛围下，按照5℃·min-1的升温速率从常温升至450℃，从记录的DSC曲线上求出295℃附近放热分解峰的峰面积（A295）。按照下式计算出脱乙酰度[7]，每个样品平行测定3次。

1.2.4电位滴定法准确称量0.25g壳聚糖样品，加入足量的0.10mol·L-1HCl标准溶液搅拌至完全溶解后，边逐步滴加0.10mol·L-1NaOH标准溶液，边记录溶液pH的变化，滴定至第二突跃点结束后，绘制pH-VNaOH滴定曲线，根据电位滴定突跃点时消耗的NaOH标准溶液体积，计算出壳聚糖的氨基含量和脱乙酰度[4]，每个样品平行测定3次。

式中CNaOH：NaOH标准溶液的浓度，mol·L-1；V1：到达第一突跃点消耗NaOH标准溶液的体积，mL；V2：到达第二突跃点消耗NaOH标准溶液的体积，mL；mdry：干燥样品重，g；16.02，氨基摩尔质量，g·mol-1；WNH2：壳聚糖的氨基含量，%；203.2为GlcNAc基本结构单元摩尔质量，g·mol-1；42.04：GlcNAc与GlcN基本结构单元摩尔质量之差，g·mol-1；为壳聚糖脱乙酰度，%。

2　结果与讨论

2.1DSC与1H NMR的比较

壳聚糖的差示扫描量热曲线，见图2。

图2　壳聚糖样品DSC曲线Fig.2DSC curve of chitosan

在110℃附近的吸热峰（A峰），归属于壳聚糖中自由水与结合水的蒸发。在295℃附近的放热分解峰（B峰），是由于壳聚糖中2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖的分解所致。在400℃附近放热分解峰（C峰），则由于壳聚糖中2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖的分解。随着壳聚糖脱乙酰度的增大，B峰的峰高与峰面积逐渐增大，而C峰的峰高与峰面积则相应减少。差示扫描量热法与1H NMR法分别测定壳聚糖脱乙酰度的结果，见表1。

表1　差示扫描量热法与1H NMR测定结果比较Tab.1Comparison with the result of DSC and1H NMR

从表1中可见，差示扫描量热法与1H NMR测定结果最大相差仅为0.81%，且标准偏差均小于1.5%，表明方法具有较好的精密度。在95%置信度下，对差示扫描量热法与1H NMR测定结果进行t检验，tcalc值均小于ttab，故而两种方法测定结果无统计学显著性差异。

2.2电位滴定法与1H NMR的比较

电位滴定法与酸碱滴定法测定壳聚糖脱乙酰度原理类似，利用OH-离子分别中和壳聚糖溶液中过量HCl和质子化氨基，二者消耗NaOH溶液体积差（V2-V）1即为中和质子化氨基所需碱溶液体积，滴定曲线见图2。

图2　电位滴定曲线Fig.2Curve of potentiometric titration

表2为电位滴定法与1H NMR法分别测定壳聚糖脱乙酰度的结果，电位滴定法与1H NMR测定结果最大相差为3.92%，且标准偏差与差示扫描量热法相比较大，其原因为壳聚糖仅溶于强酸性溶液，当样品溶液滴定至弱酸性时，壳聚糖沉淀开始逐渐析出，并粘附于玻璃电极的膜表面，溶液变得越来越浑浊与粘稠，从而严重干扰电极对溶液H+活度的响应，延长了测定时间[9]。在95%置信度下，对电位滴定法与1H NMR测定结果进行t检验，tcalc值均小于ttab，两种方法测定结果也无统计学显著性差异，但二者的差值与“2.1”中tcalc与ttab的差值相比较小，表明与电位滴定法相比，差示扫描量热法与1H NMR测定结果更为接近。

表2　电位滴定法与1H NMR测定结果比较Tab.2Comparison with the result of potentiometric titration and1H NMR

2.3稳定性

采用差示扫描量热法和电位滴定法，在不同时间段下，分别测定同一壳聚糖样品脱乙酰度，见表3。

表3　两种方法稳定性比较（n=3）Tab.3Compare with the stability of two methods（n=3）

差示扫描量热法在不同时间段下测定结果之间几乎一致，最大相差仅为1.01%，没有明显变化，但电位滴定法随着样品溶液放置时间的延长，测定结果不断偏高，这可能由于在溶液中H+的催化作用下，β-1,4糖苷键发生断裂,导致壳聚糖发生水解，影响结果的测定[10]，而差示扫描量热法由于直接测定固体样品，从而克服了样品水解对结果产生的干扰，具有较好的稳定性。

2.4重现性

分别对差示扫描量热法与电位滴定法的重现性进行考察，结果见表4。

表4　两种方法重现性比较（n=3）Tab.4Compare with the robustness of two methods（n=3）

两种方法在不同环境下的测定结果之间均较为一致，且与1H NMR测定结果相近，表明采用两种分析方法测定壳聚糖脱乙酰度时均具有较好的重现性。

3　结论

从上述试验结果可知，与电位滴定法相比，差示扫描量热法与1H NMR测定结果更为接近，且标准偏差均小于1.5%，具有较好的准确度和精密度，由于直接测定固体样品，从而无需预处理样品和配置、标定、储存标准溶液，避免了壳聚糖的水解干扰测定结果，具有较好的稳定性。同时，差示扫描量热法操作简便、快速，结果重现性好，从而可满足相关工业生产快速检测要求。

［1］蒋挺大.壳聚糖［M］.北京：化学工业出版社，2001.

［2］谢宇.壳聚糖及其衍生物制备与利用［M］.北京：中国水利水电出版社，2010.

［3］中华人民共和国农业部.SC/T 3403-2004.甲壳质与壳聚糖［S］.北京：中华人民共和国农业部，2005.

［4］贾志慎，李奇彪.双突跃电位滴定法测定壳聚糖脱乙酰度［J］.化学世界，2001，41（5）：240-241.

［5］Hirai A，Odani H，Nakajima A.Determination of degree of deacetylation of chitosan by1H NMR spectroscopy［J］.PolymerBulletin，1991，26（1）：87-94.

［6］American Standard Test Method，ASTMInternational，［2003］.http: //www.astm.org.

［7］Guinesi L S，Cavalheiro E T G.The use of DSC curves to determine the acetylation degree of chitin/chitosan samples［J］.ThermochimicaActa，2006，444（2）：128-133.

［8］Santos Z M，Caroni A L P F，Pereira M R，et al.Determination of deacetylation degree of chitosan：a comparison between conductometric titration and CHN elemental analysis［J］.Carbohydrate Research，2009，344（18）：2591-2595.

［9］WangC，Yuan F，Jin L，et al.Evaluation of the deacetylation degree of chitosan with two-abrupt-change coulometric titration［J］.Electroanalysis，2015，55（4）：885-893.

［10］董岸杰，孙多先.壳聚糖的水解反应动力学研究［J］.高分子材料科学与工程，2000，16（2）：41-43.

Determination of the degree of deacetylation of chitosan by different methods

JI Jian-hua
（Department of Pharmacology,Vocation and Technology College of Hanzhong,Hanzhong 723000,China）

The accuracy result of differential scanning calorimetry（DSC）and potentiometric titration was evaluated by1H NMR method as standard reference.The research revealed that the DSC resultsweremore closed to those from1H NMR and the standard deviations were lower than 1.5%,which possessed better accuracy and precision.In addition,the differences between inter-day and inter-time were very small showing the stability and robustness of the technique.Compare with potentiometric titration,with merit of simplicity,convenience,quickness, directly measured solid samplewhich no needsfor the preparation,standardization,storage of the standard solutionandpretreatment needless.Thereby,it could satisfy the demand of rapid testing of corresponding industrial production.

chitsoan；degree of deacetylation；differential scanning calorimetry；potentiometric titration；method comparison

O657.99

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20161123

2016-07-06

纪建华（1982-），男，陕西汉中人，讲师，硕士，主要从事药物分析教学与研究。