罗格列酮对重症急性胰腺炎大鼠胰腺氧化应激的影响

陈 辰，郭闻一，余 佳，赵凯亮，王卫星



罗格列酮对重症急性胰腺炎大鼠胰腺氧化应激的影响

陈 辰，郭闻一，余 佳，赵凯亮，王卫星

目的 探讨罗格列酮(rosiglitazone，ROSI)对重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)大鼠胰腺组织氧化应激的影响。方法 雄性SPF级SD大鼠60只，按随机数字表法随机分为3组：假手术组(shamoperationgroup，SO组)、SAP组、ROSI组,每组20只。胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备SAP模型。ROSI组在造模后5min经股静脉注射ROSI(6mg/kg)，SO组和SAP组则注射等量生理盐水。术后12h剖杀大鼠，统计各组大鼠死亡率。检测血清淀粉酶(amylase，AMY)；检测胰腺组织一氧化氮(nitricoxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)水平；胰腺组织行病理学检查；酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)检测血清白介素-1β(interleukine-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukine-6，IL-6)水平。免疫印迹法(westernblotting)检测胰腺组织诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)、内皮细胞型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)蛋白水平。结果SAP组死亡2只大鼠；SO组和ROSI组无大鼠死亡。SAP组大鼠AMY、IL-1β、IL-6、NO、MDA、胰腺病理评分均较SO组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；ROSI组干预后上述指标较SAP组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。SAP组GSH-Px水平较SO组明显下降，给予ROSI干预后GSH-Px水平有所上升，但仍低于SO组[(49.01±9.42)U/mgvs (59.81±22.43 )U/mg]，差异均有统计学意义(P<0.05)。SO组胰腺组织iNOS和eNOS蛋白呈低表达，SAP组iNOS和eNOS蛋白表达水平较SO组明显升高[(1.90±0.16 )vs(0.75±0.09)、(0.37±0.09)vs(0.09±0.01)],差异有统计学意义(P<0.05)，ROSI干预后其表达水平均下降[(1.31±0.18)vs(1.90±0.16)、(0.23±0.08)vs(0.37±0.09)]，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 罗格列酮对SAP大鼠胰腺损伤具有保护作用，其机制与抑制氧化应激、减少炎性反应因子产生有关。

罗格列酮；胰腺炎；氧化应激；炎性反应因子

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是外科常见的急腹症，若发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)可导致严重的脏器功能障碍及全身炎性反应综合征，病死率极高[1]。目前研究认为，胰酶消化、氧化应激、炎性反应因子，以及局部缺血缺氧等是造成急性胰腺炎发生发展的因素[2]，其中氧化应激发挥较为重要的作用[3]。罗格列酮(rosiglitazone，ROSI)是噻唑烷二酮类药物，有研究显示其在多种疾病中发挥抗氧化、抗炎作用[4]。本研究建立大鼠SAP动物模型，通过罗格列酮在SAP过程中的作用，旨在证明罗格列酮对SAP大鼠胰腺损伤具有保护作用，其机制与抑制氧化应激、减少炎性反应因子产生有关。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 罗格列酮(ROSI)购自Cayman公司。牛磺胆酸钠(sodium taurocholate，STC)购于Sigma公司。一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。白介素-1β(interleukine-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukine-6，IL-6)ELISA检测试剂盒均购自Abcam公司。β-肌动蛋白(β-actin)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、内皮细胞型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗体均购自Abcam公司。

1.2 动物模型和分组 雄性SPF级SD大鼠60只(购自武汉大学动物实验中心)，体重200～220 g，使用随机数字表法分为3组：假手术组(SO组)，重症急性胰腺炎组(SAP组)，罗格列酮干预组(ROSI组)，每组20只。参照文献[5]的方法，采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g)制备SAP模型。SO组操作同SAP组，但胆胰管注入等量生理盐水。ROSI组造模后5 min经股静脉注射罗格列酮(6 mg/kg)，SO组和SAP组则注射等量生理盐水。术后12 h剖杀大鼠。下腔静脉采血，4000 r/min离心，留取血清标本-20 ℃保存备用。取胰头部胰腺组织10%甲醛固定。其余胰腺组织经液氮冻存后，放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 指标检测 (1)统计各组大鼠病死率；(2)血清淀粉酶(AMY)使用武汉大学人民医院检验科全自动生化仪检测；(3)胰腺组织经10%甲醛固定24 h，石蜡包埋制片，HE染色后光镜观察，由2名病理医师，根据Schmidt 等[6]的方法，盲法分别对胰腺组织行病理学评分；(4)按照试剂盒说明书，采用ELISA法检测各组大鼠血清IL-1β、IL-6水平；(5)取新鲜胰腺组织，采用高速组织匀浆机(T10型，上海越磁电子科技有限公司)制备匀浆，以3000 r/min离心5 min后，取上清组织匀浆液，按照试剂盒说明书分别检测各组大鼠胰腺组织NO、MDA、GSH-Px活性与水平；(6)免疫印迹法(western blotting)检测各组大鼠胰腺组织iNOS、eNOS蛋白水平。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况和死亡情况SO组大鼠精神状况正常；SAP组大鼠基本处于嗜睡状态，ROSI组大鼠精神状况相比SAP组大鼠稍好。SO组与ROSI组大鼠无死亡情况，SAP组大鼠死亡2只。

2.2 血清AMY的变化 与SO组比较，SAP组大鼠血清AMY水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；ROSI组上述指标较SAP组有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)，但仍高于SO组(P<0.05，表1)。

2.3 胰腺组织病理评分改变SO组大鼠胰腺组织腺泡结构正常，未见水肿、坏死、出血，以及炎性浸润等改变；SAP组大鼠胰腺组织可见大片状的腺泡坏死，残存胰腺组织明显水肿，腺泡间血管充血，在坏死区域可见片状出血，炎性细胞浸润明显；ROSI组腺泡坏死范围缩小、水肿与炎性细胞浸润情况较SAP组减轻(图1)。对比各组大鼠胰腺组织病理评分，SAP组与SO组比较评分明显升高，ROSI组胰腺病理评分较SAP组有所下降，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.4 胰腺组织NO、MDA、GSH-Px的变化 与SO组比较，SAP组大鼠胰腺组织NO、MDA水平明显升高；ROSI组上述指标较SAP组下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；SAP组大鼠胰腺组织GSH-Px水平较SO组明显下降，给予ROSI干预后GSH-Px水平有所上升，但仍低于SO组，差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。

组别nAMY(U/L)病理评分SO组201343.9±333.10.50±0.13SAP组187198.8±779.8①10.50±1.32①ROSI组203687.9±561.2①②6.85±1.04①②

注：SO为假手术组，SAP为重症急性胰腺炎组，ROSI为罗格列酮干预组。与SO组比较，①P<0.05；与SAP组比较，②P<0.05

图1 3组大鼠胰腺组织病理改变(HE，×200)

组别nNO(nmol/L)MDA(nmol/mg)GSH-Px(U/mg)SO组204.77±0.910.40±0.0959.81±22.43SAP组1811.02±2.01①1.17±0.31①39.93±15.18①ROSI组208.03±0.78①②0.82±0.14①②49.01±9.42①②

注：SO为假手术组，SAP为重症急性胰腺炎组，ROSI为罗格列酮干预组；与SO组比较，①P<0.05；与SAP组比较，②P<0.05

2.5 血清IL-1β、IL-6的变化SAP组大鼠血清IL-1β、IL-6水平相比于SO组明显升高，在给予ROSI干预后上述指标均有明显下降，但仍高于SO组，差异均有统计学意义(P<0.05，表3)。

2.6 胰腺组织iNOS、eNOS蛋白表达SO组胰腺组织iNOS和eNOS蛋白呈低表达，SAP组iNOS和eNOS蛋白表达水平较SO组明显升高(P<0.05，表3)；ROSI干预后上述指标的蛋白表达水平均下降(P<0.05，图2)。

组别nIL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)iNOSeNOSSO组20140.08±34.1980.92±25.070.75±0.090.09±0.01SAP组18336.90±88.32①392.36±86.95①1.90±0.16①0.37±0.09①ROSI组20187.12±24.21①②276.44±46.18①②1.31±0.18①②0.23±0.08①②

注：SO为假手术组，SAP为重症急性胰腺炎组，ROSI为罗格列酮干预组；与SO组比较，①P<0.05；与SAP组比较，②P<0.05

图2 3组大鼠胰腺组织iNOS和eNOS的表达

3 讨 论

急性胰腺炎主要是由胰酶异常激活引起胰腺自身消化的疾病，受胰酶消化的胰腺腺泡细胞可以释放更多的激酶，同时提升组织内的氧化应激水平，导致炎应反应向全身扩展，引起全身炎性反应综合征[7]，但其具体的细胞应激及信号传导通路尚不十分清楚[8, 9]。氧化应激是细胞应激过程中常见的改变，供氧和供能不足均可以导致细胞出现氧化应激状态[10]。细胞氧化应激存在多种启动机制，其中作为能量转化器的线粒体发挥重要作用。在应激状态下，参与线粒体氧化磷酸化过程的还原性物质被大量消耗，产生的活性氧自由基及氮氧自由基可引起线粒体DNA及蛋白质损伤[11-14]。因此氧化应激在细胞的应激过程中发挥重要作用。

MDA含量反应机体氧化应激程度；GSH-Px是体内一种重要的过氧化物分解酶，可反映机体抗氧化能力。本研究结果发现，与SO组比较，SAP组AMY水平明显上升，胰腺组织病理评分显著增加，证实重症急性胰腺炎造模成功；同时NO和MDA含量明显增加，而GSH-Px下降，说明SAP大鼠病程中存在明显的氧化应激改变，且相应的炎性反应因子如IL-1β、IL-6水平也随之上升。因此，我们认为在SAP过程中胰腺组织氧化应激水平升高，导致组织损伤，刺激各种炎性介质释放，引起全身炎性反应。

罗格列酮(ROSI)是噻唑烷二酮类药物，主要用于2型糖尿病的治疗。新近的研究显示，它具有抗氧化作用及抗炎作用，ROSI可以通过激活PPAR-γ下调氧化酶的产生来发挥抗氧化作用[15]。本研究发现，SAP大鼠在使用ROSI干预后，胰腺组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)的表达下降，NO产生减少，氧化应激程度降低，表现为MDA水平下降、GSH-Px含量上升；同时与胰腺炎严重程度相关指标如AMY、胰腺病理评分等均有明显改善，血清中炎性反应因子含量随之降低。

综上所述，本研究结果初步证实ROSI对SAP胰腺损伤具有保护作用，其机制与抑制氧化应激、减少炎性反应因子产生有关。本研究是采用动物实验，而在细胞实验中，针对胰腺腺泡细胞，ROSI是否仍具有前述的作用机制，并且ROSI激活PPAR-γ后，具体通过何种分子途径来减少一氧化氮合成酶的产生等问题，均有待进一步研究证实。

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(2016-04-11收稿 2016-04-27修回)

(责任编辑 郭 青)

Effect of rosiglitazone on oxidative stress in rats with severe acute pancreatitis

CHEN Chen, GUO Wenyi, YU Jia, ZHAO Kailiang, and WANG Weixing.

Department of Hepatobiliary and Laparoscopic Surgery, Renming Hospital, Wuhan University, Wuhan 430060, China

Objective To investigate the effect of rosiglitazone on oxidative stress in rats with severe acute pancreatitis.Methods Sixty male SD rats were randomly divided into 3 group(n=20): sham operation group (SO group), severe acute pancreatitis group(SAP group) and rosiglitazone treatment group (ROSI group). SAP model was induced by retrograde infusion of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. The rats in ROSI group were injected rosiglitazone(6 mg/kg) throngh femoral vein 5 minutes after the operation. In SO group and SAP group saline partes equales were injected. Rats were killed at 12 h after operation. Analysis of the mortality of rats in each group was conducted. Detecting amylase(AMY), nitric oxide(NO), malondialdehyde(MDA)、glutathione peroxidase(GSH-Px), pancreas pathologic score. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)and analysis of serum interleukine-1β (IL-1β), interleukine-6 (IL-6) levels were carried out. The expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)、endothelial nitric oxide synthase(eNOS)in pancreas tissue were measured by Western blotting method.Results Two rats died in SAP group, no rat died in SO group and ROSI group. Compared with SO group, the levels of AMY, NO, MDA and pancreas pathologic score were significantly increased in SAP group.The level of GSH-Px activity decreased significantly in SAP group than in SO group[(39.93±15.18)vs(59.81±22.43) U/mg], which was higher in ROSI group than in SAP group[(49.01±9.42)vs(59.81±22.43) U/mg] (P<0.05). The expression of iNOS and eNOS in pancreas tissue increased significantly in SAP group than in SO group[(1.90±0.16)vs(0.75±0.09)，(0.37±0.09)vs(0.09±0.01)] (P<0.05); compared with SAP group, these indexes decreased significantly in ROSI group[(1.31±0.18)vs(1.90±0.16)、(0.23±0.08)vs(0.37±0.09)] (P<0.05).Conclusions Rosiglitazone exerts the protective effect on severe acute pancreatitis through inhibiting oxidative stress and downregulating the expression of inflammatory cytokine.

rosiglitazone；pancreatitis；oxidative stress；inflammatory cytokine

陈 辰，博士，主治医师。

430060，武汉大学人民医院肝胆腔镜外科

王卫星，E-mail:sate.llite@163.com

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