响应面法优化青箱子总皂苷提取工艺

徐　霞　张　洪　李　晨　张　敏　刘　芳*



响应面法优化青箱子总皂苷提取工艺

徐霞张洪李晨张敏刘芳*

（湖南科技学院 化学与生物工程学院，湖南 永州 425199）

文章通过响应面分析法，对溶剂法提取青箱子中的总皂苷工艺进行研究。实验结果表明，显著性影响因素排序为：提取温度>提取时间>料液比；在提取温度90oC、提取时间为2 h、料液比为1: 25的条件下，青箱子总皂苷提取率可高达0.86 %。

响应面法；青箱子；总皂苷；提取工艺

1　引　言

青葙子是苋科植物，一般生长在我国大部分地区的平原、田边、丘陵以及山坡[1]。常以煎煮法与其他药材配伍入药，是较为常用的药材之一。在中医的理论中，青葙子味苦，性微寒，归肝经，具有清肝泻火，明目退翳的功效。主治视力模糊、目赤肿痛、目生翳膜和肝火眩晕[2]。在现代药理学研究中，青箱子还具有护肝[3]、抗肿瘤[4]、抗糖尿病[5]等功效。此外，青箱子的水提液不仅可以提高晶状体的抗氧化能力，还可以预防晶状体上皮细胞的凋亡等[6,7]。

响应面法具有试验次数少、精确度高、能研究几种因素间交互作用[8]，所得信息量大且直观。所采用的是非线性预测模型拟合，在中心点进行重复试验以提高精确度[9-13]。本实验通过加热回流提取法提取其中有效成分青葙总皂苷，然后通过单因素优化法和响应面分析法来优化青葙总皂苷的提取工艺，使青葙子这一传统的中药材能更好地在现代医疗市场中发挥作用。

2　实验部分

2.1实验仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司）、电热鼓风干燥机（上海一恒科学仪器有限公司）、高效液相色谱CBM-20A型（岛津企业管理（中国）有限公司）、中药材粉碎机FW135、177型（天津市泰斯特仪器有限公司）、循环水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）型（巩义市予华仪器有限公司）、电子天平IA3003型（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

2.2实验试剂

青葙子（市售药材）、60%乙醇、蒸馏水、青葙总皂苷标准品（上海伊卡生物技术有限公司）、乙腈（高效液相色谱用溶剂，上海陆都化学试剂厂）、0.1%冰乙酸水溶液。

2.3方法

（1）青葙子材料的预处理。干燥青葙子药材200 g，粉碎，在干燥且处于室温的条件下保存。

（2）青葙总皂苷的提取。精确称取青葙子5 g，置于250 mL圆底烧瓶中，按1:20的料液比（即加入100 mL 60%乙醇），然后组装好加热回流提取装置，提取的时间为1 h，提取温度为80oC，趁热抽滤，合并滤液，将所得滤液装载于离心管中，在4000 r/min的速度下离心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中。

（3）青葙总皂苷的含量测定（高效液相色谱法）。标准曲线绘制：取青箱总皂苷标准品适量,置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容。分别配置成浓度0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液。用0.45 μm滤膜过滤，作为标准品溶液备用。

液相色谱条件：检测器：紫外检测器（UV）；检测波长：203 nm；流动相：乙腈-0.1 %冰醋酸水溶液（32:68）；柱温：30oC；色谱时间：20 min；流速：1.0 mL/min。

分别精密吸取以上各种浓度的标准品溶液各10L，按编号依次进样，通过测得的数据来绘制标准曲线，测得的标准曲线的方程为y=13175x－3336.8（R2=0.9991），如图1所示。

总皂苷浓度(mg·mL-1)

图1.青葙子总皂苷标准曲线

（4）青葙总皂苷含量的测定。分别精密吸取各组供试品溶液10L，按编号依次进样，通过绘制的标准曲线来计算青葙总皂苷的收率。收率的计算公式为：收率（%）=供试品溶液的溶度×供试品溶液的体积÷原料的质量×100%。

3　实验结果与讨论

3.1单因素实验

总皂苷的化学性质不是特别稳定，依据不稳定的化学性质选定总皂苷三个影响因素及提取时间、提取温度、料液比，探究其对总皂苷得率的影响。

（1）提取时间单因素实验。固定料液比为1:20，提取温度80oC，提取2次，分别把每次提取的时间设为0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h，趁热抽滤，合并滤液，将所得滤液装载于离心管中，在4000 r/min的速度下离心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中。记录时间对青葙总皂苷提取率的影响。实验结果如表1所示。

由表1表明，随着加热时间的增加，总皂苷的收率在2.0 h前增加显著，在2.0 h后收率缓慢减少。由于总皂苷的化学性质不是特别稳定，所以加热时间过长，会导致总皂苷收率减少。

表1.时间单因素实验结果

试验编号123456 时间（h）0.501.002.003.004.005.00 收率（%）0.250.250.820.670.600.58

（2）提取温度单因素实验。固定料液比为1:20，提取2次，每次提取时间0.5 h，分别在温度为30oC、40oC、50oC、60oC、70oC、80oC、90oC、100oC条件下提取，趁热抽滤，合并滤液，将所得滤液装载于离心管中，在4000 r/min的速度下离心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中，实验结果如表2所示。

由表 2表明，随着实验提取温度的升高，在90oC前总皂苷的收率不断增加，而在90oC后总皂苷的收率开始减少，因而选择提取温度为80oC ~90oC作为提取的较适温度。

表2.温度单因素实验结果

试验编号12345678 温度（℃）30.040.050.060.070.080.090.0100 收率（%）0.270.360.510.630.680.790.860.75

（3）料液比单因素实验。固定提取温度70oC，提取2次，每次提取时间0.5 h，料液比分别采取1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40的料液比进行提取，趁热抽滤，合并滤液，将所得滤液装载于离心管中，在4000 r/min的速度下离心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中，结果见表3。

由表3表明，随着料液比的增加，总皂苷的收率在1: 25前缓慢增加，在1: 25后收率反而缓慢下降，所以料液比在1:25左右收率较高。

表3.料液比单因素实验结果

试验编号1234567 料液比1:101:151:201:251:301:351:40 收率（%）0.610.660.680.840.800.760.72

表4.响应面分析因素与水平

水平 时间A/ h 温度B/ ℃ 料液比C/ g·mL-1 -18011:20 09021:25 110031:30

3.2 响应面分析法实验设计

响应面法实验：根据Box Benhnken的中心组合实验设计原理[14],综合上述实验对总皂苷提取率的影响结果选取温度、时间和料液比这三个因素，由单因素实验设计响应面分析实验为3因素3水平的实验方案。响应面分析因素与水平见表4。响应面分析结果见表5。

表5.响应面分析结果

序号ABC收率 1-1-100.13 2-1100.59 31-100.53 41100.84 50-1-10.27 60-110.45 701-10.69 80110.80 9-10-10.37 1010-10.71 11-1010.64 121010.95 130001.01 140001.05 150000.96 160000.93 170000.97

对提取温度、提取时间、料液比作如下转换：A=（t-90）/10 ,B=（T-2）/1 , C=（2-30）/5 ，响应值（Y）是以三次实验所取得的总皂苷收率的平均值，响应面分析结果如表5所示。析因实验是1~12组实验，中心实验是13~15组实验，从而估计实验误差，实验分析结果如图 2~图 4所示。使用统计分析软件Design-expert进行数据处理分析，回归分析结果如表 6所示。因子经回归拟合，解得回归方为：Y=0.98+0.13A+0.16B+0.16C-0.038AB-0.017AC-0.0075BC-0.29A2-0.17B2-0.14C2。表 6结果显示决定系数R2=0.9146，则模型的拟合度很好。根据F的检验可知，概率P（F>Fα）的值越小，则相应变量的显著程度越高。表6结果表明，三种影响因素的一次项二次项都是高度显著，则说明各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。综上述分析，三种影响因素的排序为提取温度>提取时间>料液比。

图2-图4是因素交互作用的响应面和等高线。图3表明，A的水平变化等高线数目比B的数目多，说明提取时间对总皂苷的收率影响不显著。由图3所示，当提取时间和温度不变时，随着料液比的增加收率呈现先增加后减少的趋势。原因是随着料液比的增加，溶液的黏度会缓慢降低，对总皂苷的溶出有利。若是料液比过大，会使总皂苷含量降低。由图2-图4可知，3个响应面开口均为向下的凸型曲线，青箱子总皂苷收率存在极大值，说明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围之中。

表6.青葙总皂苷提取回归分析结果

方差来源自由度平方和均方F值P（F>Fα）显著性 A10.210.21100.12< 0.0001高度显著 B10.300.30140.50< 0.0001高度显著 C10.0800.08037.910.0005高度显著 AB15.625E-0035.625E-0032.670.1465不显著 BC12.250E-0042.250E-0040.110.7536不显著 AC11.225E-0031.225E-0030.580.4710不显著 A210.130.1359.900.0001高度显著 B210.350.35165.80< 0.0001高度显著 C210.0860.08640.950.0004高度显著 回 归91.220.1464.00< 0.0001高度显著 误 差70.0152.110E-003 失拟项30.0370.0125.700.063 纯误差48.720 E-0032.180 E-003 总 和161.23 R2=0.9146

图2.提取时间与提取温度对总皂苷收率影响的响应面与等值线

图3.提取温度与料液比对总皂苷收率影响的响应面与等值线

图4.提取时间与料液比对总皂苷收率影响的响应面与等值线

3.3 工艺条件优化及验证实验

在回归方程Y=0.98+0.13A+0.16B+0.16C-0.038AB-0.017AC-0.0075BC-0.29A2-0.17B2-0.14C2中所示，二次项系数均为负数。使用Design Expert 软件对工艺条件优化，在模型取值范围内选择最低点为起点，根据模型使用快速上升法进行优化，结果表明提取时间为2.1 h、提取温度为90.3oC、料液比为1: 25.35且理论预测提取率为0.88 %。

为检验实验结果是否与真实情况相一致，考虑到实际操作的便利，将条件修正为室温条件下，提取时间为2 h、提取温度温度为90oC、料液比为1:25。在该条件下进行三次平行试验，青箱子总皂苷的平均提取率为0.86 %，与理论预测值相比，其相对误差约为0.84 %，重复性很好，说明优化结果可靠。

4　结　论

由响应面实验的分析结果，得到提取温度是青箱子总皂苷的最佳控制点，由优化条件进行验证实验，在提取温度90oC、提取时间为2 h、料液比为1:25的条件下，青箱子总皂苷提取率可高达0.86%。本实验通过简单易行的操作方法将总皂苷成分提取出来，为以后的研究提供一定的参考。

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（责任编校：宫彦军）

2016－06－20

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（湘教通[2015]269号472）。

徐霞（1993－），女，吉林蛟河人，湖南科技学院化学与生物工程学院制药工程系学生。

刘芳(1972－)，女，湖南衡山县人，湖南科技学院副教授，研究方向为天然有机。

R284.2

A

1673-2219（2016）10-0063-04