环介导等温扩增终端产物检测及结果判断的研究进展

2016-12-07付振芳汪小福徐俊锋李玥莹

浙江农业科学 2016年5期

关键词：指示剂等温浊度

付振芳，汪小福，徐俊锋，李玥莹

（1.沈阳师范大学化学与生命科学学院，辽宁沈阳 110034；2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州 310021）

环介导等温扩增终端产物检测及结果判断的研究进展

付振芳1，2，汪小福2，徐俊锋2，李玥莹1*

（1.沈阳师范大学化学与生命科学学院，辽宁沈阳 110034；2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州 310021）

环介导等温扩增（LAMP）技术在2000年被日本学者Notomi等提出，并用琼脂糖凝胶电泳及SYBRGreenⅠ荧光定量的方法对其产物、扩增灵敏度进行了分析。为了使LAMP终产物检测更加简单、直观、省时，国内外科学家进行了大量的研究，先后提出浊度分析法、HNB指示剂、蜡丸染料等简便易操作的LAMP终产物检测及结果判断方法，目前应用较多的是琼脂糖凝胶电泳、浊度分析法、HNB指示剂法与SYBRGreenⅠ指示剂法。本文就近年来LAMP终产物检测及结果判断进行了综述，汇总了近年来LAMP终产物检测方法，以期为未来LAMP终产物检测方法的发展提供新的思路。

环介导等温扩增（LAMP）；产物检测；结果判断

2000年，日本学者Notomi等在《Nucleic AcidsResearch》上提出用于核酸扩增的环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）技术，该技术运用的2组引物—上/下游外引物（F3/B3）、上/下游内引物（FIP/BIP）能够特异性识别靶基因上6个位点，在65℃恒温条件下首次成功完成对M13mp18、HBV、前列腺特异性抗原mRNA的扩增，扩增灵敏度为6个DNA拷贝［1］。

靶基因在BstDNA聚合酶的作用下，60～65℃等温扩增40～60min即可完成对靶基因的高效扩增。扩增过程可大致分为2个步骤：（1）形成LAMP的基础结构。F3首先结合到靶基因的3’端扩增出靶基因的互补序列，接着B3结合到该互补序列扩增出靶基因，该靶基因两端的F3/B3可自身成环，LAMP基础结构形成；（2）扩增循环。FIP/BIP依次结合到LAMP基础结构的两端，把基因不断扩增延伸，最终形成靶基因与其互补序列交替出现、不同片段长度的扩增产物，该产物呈花椰菜状。随着反应进行，大量焦磷酸根从 dNTPs上脱落，游离焦磷酸根与体系中的Mg2+结合，形成稳定的白色沉淀。

LAMP核酸扩增技术自提出以来，对LAMP的改良优化大多集中在实验条件的优化，如Nagamine等［2］发现环引物FLP/BLP的加入能进一步提高LAMP的扩增效率，其他还有针对不同靶基因进行的反应时间、反应温度、反应体系中各组分的浓度（如Mg2+、甜菜碱等）等的优化探究。而LAMP终产物检测方面使用最多的方法主要是凝胶电泳、浊度检测、SYBRGreenⅠ荧光检测。

与其他核酸扩增技术相比，LAMP扩增时间短、灵敏度高、特异性好、仪器设备要求低，为实验条件有限的基层实验室或者现场的快速检测提供了可能，主要用于致病性微生物，如细菌［3-7］、病毒［8-13］、真菌［14］、支原体［15］、衣原体［16］，致病性寄生虫［17］，转基因成分［18-19］，肿瘤［20］，胚胎性别鉴定［21］、安全用药［22］、食品过敏原［23］，纯度检测［24］等领域的核酸扩增。但由于LAMP灵敏度高、扩增效率高的特点，如果依旧使用从传统的凝胶电泳方法检测扩增产物，极易造成实验室污染或者小面积气溶胶污染，影响下次实验的可靠性或直接导致实验失败；而裸眼浊度观察虽然大大缩短了检测时间，但具有一定的主观性。所以研究不开盖即完成对LAMP扩增产物的检测对LAMP技术的进一步广泛使用有着重要意义。

1 LAMP产物检测技术

LAMP核酸扩增技术具有的扩增时间短、灵敏度高、特异性高、扩增效率高等优点使其自问世以来便得到广泛的关注。截至目前，国内外科学家已经成功将该技术用于致病性微生物、致病性寄生虫、转基因成分、肿瘤、胚胎性别鉴定、安全用药、食品过敏原、纯度检测等领域的核酸扩增。但相较于LAMP扩增广泛的应用领域，LAMP技术的产物检测方法用得较多的有琼脂糖凝胶电泳、浊度分析、SYBRGreenⅠ荧光检测技术。

1.1 电泳

LAMP电泳方法、原理与普通PCR电泳相同，即将扩增产物按一定比例与DNA染料混合，加样、电泳，最终通过凝胶电泳显像系统成像后观察条带位置。所不同的是，LAMP的扩增产物呈特异的梯状条带。LAMP的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳［25］，琼脂糖凝胶电泳是较常用的方法，也可以用限制性内切酶EcoRⅠ对LAMP产物进行酶切，产生与理论片段大小相符的产物片段。

1.2 荧光染料法

荧光染料与双链DNA双螺旋小沟区域结合后荧光大大增强，因此可以利用荧光信号强度定性指示双链DNA的数量。荧光染料法用到的染料主要有SYBRGreenⅠ、GoldView以及PMA。其中SYBRGreenⅠ的应用最为广泛。

SYBRGreenI-LAMP。SYBRGreenⅠ是一种绿色激发波长染料，在游离状态下发出微弱的荧光，与双链DNA结合后荧光大大增强。在LAMP产物中加入SYBRGreenⅠ溶液，阴性结果为橙色，阳性为荧光黄或紫外灯下发出荧光。因此，SYBR GreenI可以用来指示LAMP扩增。根据SYBR GreenⅠ加入的方式，SYBRGreenI-LAMP主要有普通指示法、管壁法、染料蜡丸［26-27］等方法。普通指示法，反应结束后开盖直接加入SYBRGreenⅠ溶液；管壁法，反应前将SYBRGreenⅠ加在管盖内壁上，反应结束后离心或颠倒混匀离心管，使盖内壁的SYBRGreenⅠ与反应液混合，最后观察离心管中反应液颜色，该方法虽避免了开盖，但SYBRGreenⅠ会在一定程度上抑制LAMP扩增，所以盖管盖时要防止管盖上的指示剂溶液与反应液混合；染料蜡丸，将SYBRGreenⅠ染料包裹于蜡丸中，反应前体系中加入一粒，扩增结束后95℃处理5min，使蜡丸融化释放SYBRGreenⅠ染料，染料与扩增产物结合释放大量荧光，冷却后蜡丸凝固并把反应终产物封于反应管底部，这样在很大程度上降低了污染。以上方法只能在扩增终点定性地判断LAMP是否扩增。为了实现对扩增过程的实时监测，以普通PCR荧光定量法为参考衍生出实时荧光法。

另外2种荧光染料是GoldView与PMA。GoldView是一种新型核酸染料，与核酸结合后能产生很强的荧光信号，扩增结束后将GoldView加入反应管中混匀离心，紫外线灯下观察阳性反应管呈绿色，阴性呈橘红色［28］。PMA，叠氮溴化丙啶（propidiummonozaide），是一款具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料，倾向于结合dsDNA。PMA上的光敏性叠氮基团生成高反应性的氮宾基团，它与羟基化合物共价结合，形成不可逆的DNA修饰。PMA完全不能通过细胞膜，因此它只能选择性地修饰死细胞 “暴露”的DNA。这一特性使得它可以和LAMP联合使用，选择性地扩增活细菌DNA，而不扩增被PMA修饰的死细菌DNA，所以用PMA-LAMP可避免死细胞DNA扩增带来的活菌计数错误或非特异扩增造成的假阳性结果［29］。

1.3 基于镁离子、焦磷酸根的检测技术

LAMP反应过程中会有大量焦磷酸根（P2O4-7）从dNTPs上脱落，游离焦磷酸根与体系中的 Mg2+结合，形成稳定的白色焦磷酸镁（Mg4P2O7）沉淀。所以随着扩增的进行，体系中焦磷酸镁沉淀逐渐增多，Mg2+逐渐减少。焦磷酸镁的积累会使体系变浑浊，基于此产生LAMP浊度法。扩增结束后，用肉眼观察体系是否变浑浊或离心后底部是否有白色沉淀即可判断是否有扩增。还可使用浊度仪对体系进行终点浊度检测或者实时浊度检测。浊观察节省了时间，也避免了开盖污染，但肉眼观察判断是否有浑浊有一定的主观性，不符合客观、科学的研究要求。故不少学者开发出基于体系中Mg2+离子变化的指示剂法。

指示剂法是指根据指示剂的物理化学特性，在扩增前后加入指示剂，随着体系中 Mg2+浓度的变化，指示剂因得到或失去Mg2+进而颜色发生变化的一种方法。常用的指示剂有钙黄绿素、HNB、MUA-AuNPs、铬黑T或其衍生物、PAR钠盐等，其中钙黄绿素、HNB最为常用。

钙黄绿素（calcein，3，3′-双（甲胺二乙酸）荧光素），亮黄色粉末，溶于乙醇和碱，微溶于水；络合指示剂、荧光指示剂，与镁离子结合而成的复合物可产生强烈荧光。反应前加入钙黄绿素，此时钙黄绿素与锰离子结合为淬灭态，即无荧光产生。随着反应进行，大量产生的焦磷酸根与锰离子形成稳定的焦磷酸锰沉淀，此时镁离子取代锰离子与钙黄绿素结合，产生荧光［30］。AuNPs，纳米金（goldnanoparticles），可见光下AuNPs粒子发生表面等离子体共振，根据粒子直径大小颜色从红色变至紫色。MUA-AuNPs，是纳米金与巯基十一烷酸形成的复合物。实验时提前加入指示剂 MUAAuNPs，在体系中的Mg2+的作用下MUA-AuNPs之间相互螯合，直径变大，此时体系为紫罗兰色；扩增完成后，Mg2+与P2O4-7形成稳定的白色沉淀，此时失去Mg2+的MUA-AuNPs使得体系变成红色，因此可根据体系颜色变化来判断扩增反应的结果［31］。HNB，羟基萘酚蓝（hydroxynaphtholblue），金属离子指示剂，深紫色粉末，易溶于水和乙醇；其水溶液在pH为7～12时呈蓝色，pH＞13时呈红色。LAMP体系中提前加入HNB水溶液，起初镁离子与HNB结合使得反应体系为紫罗兰色；随着反应的进行，Mg2+与析出的 P2O4-7反应生成Mg2P2O7沉淀，HNB失去Mg2+使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色［32］。铬黑T，1-（1-羟基-2-萘偶氮）-6-硝基-2-萘酚-4-磺酸钠（eriochromeblackT），又名依来铬黑T；棕黑色粉末，溶于水，6.3＜pH＜11.6为蓝色；络合指示剂，络合物为红色。将指示剂溶液提前加入扩增体系中，反应开始时，铬黑T或其衍生物与镁离子结合成为红色，随着反应进行副产物焦磷酸根与镁离子形成沉淀，铬黑T或其衍生物失去镁离子后，由红色变为蓝色。PAR钠盐，吡啶-（2-偶氮-4）间苯二酚一钠盐或4-（2-吡啶偶氮）间苯二酚单钠盐一水物（4-（2-pyridylazo）resorcinol monosodiumsalt），橙棕色至棕色结晶粉末，易溶于水和乙醇，水溶液呈黄色，络合指示剂，原理与铬黑T相同，PAR钠盐与镁离子结合形成橘红色络合物，失去镁离子后橘红色变为黄色［33］。

1.4 与其他技术结合的检测技术

LAMP单管扩增时间短、效率高、灵敏度好，但由于LAMP引物的复杂性，单管多重LAMP扩增在实现上有一定的难度。所以LAMP与其他技术结合，实现广义上的多重扩增为解决多重LAMP扩增提供了新的思路。

LFD法。横向流动试纸条检测技术（lateral flowdipstick，LFD），该方法基于LAMP扩增原理，上游内引物由生物素（biotin）标记，同时在内引物扩增的有效区段内设计1条异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）标记的DNA探针，由FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，若结果为阳性则检测线、质控线处均出现条带，阴性结果只出现质控线一条带［34-35］。

微流控LAMP芯片系统。LAMP与微流控技术的结合在广义上解决了LAMP无法进行多重扩增以及更加快速的sample-to-answer的问题，主要有单重定性/定量LAMP芯片、多重定性/定量LAMP芯片及单重/多重集成LAMP芯片。单重定性/定量LAMP芯片扩增场所由传统的EP管改为5μL体积反应槽，一个芯片可承载多个独立反应槽，反应结束后可根据反应槽中是否有白色沉淀直接判断有无扩增（单重定性），也可以使用可见吸光光度法实时检测LAMP反应液的混浊程度可以定量样品中的目的基因（单重定量）。多重定性/定量LAMP芯片，芯片上设计有辐射状凹槽，凹槽端点为扩增池（可根据需要在扩增池中加入终点指示剂），交叉点为加样孔。加样后，样品通过此孔在毛细管拉力的作用下均匀分布到各扩增池进行LAMP扩增。反应结束后，根据反应槽中是否有白色沉淀或相应的指示剂有无阳性反应直接判断有无扩增（多重定性），或使用微型反射式光纤传感器测定每个样品的动力学曲线阀值来定量样品中原始目标基因的含量（多重定量）。单重/多重集成LAMP芯片，芯片由DNA提取室，毛细管通道和LAMP扩增室三部分组成，多重集成LAMP芯片模板拥有多个LAMP扩增室，其数量与重数相同。DNA提取完成后打开螺丝微阀使DNA进入扩增室，加入反应液，完成扩增。扩增结果通过浊度判断或加入终点指示剂［36-37］。

2 问题及展望

LAMP技术的提出打破传统核酸扩增技术需要温度循环的常规，缩短了扩增时间、提高了扩增效率，并且其灵敏度高、特异性好、不需要严苛的实验条件以及大型仪器设备、扩增结果可直接裸眼观察或者通过指示剂法直接观察的优点，为核酸扩增技术普及、条件不足的基层实验室开展实验以及现场检测提供了可能。纵观15年来的发展，LAMP产物检测技术不断优化：从传统的琼脂糖凝胶电泳到浊度观察、指示剂颜色变化等终点判断方法，再到与其他技术相结合，缩短了检测周期的同时也克服了开盖污染以及无法多重扩增的问题。但是相比于LAMP应用领域的遍地开花，LAMP检测技术的发展相形见绌，而且已有的方法依旧存在易污染等问题。电泳、浊度分析、SYBRGreenⅠ等检测方法应用较为广泛，但开盖电泳极易造成实验室污染。浊度分析不能避免肉眼观察的主观性；实时浊度分析结果虽更加客观，但依旧依赖昂贵的实验仪器，不利于LAMP方法的基层普及或现场检测。SYBRGreenⅠ提前加入会抑制LAMP扩增，扩增结束后加入又极易造成污染；染料蜡丸法的提出为指示剂的发展提供了新的思路，克服了前2个问题，但蜡丸的制作在某种程度上增加了检测成本以及时间。而指示剂 HNB、钙黄绿素等既不抑制LAMP扩增又简单易操作的方法可以为LAMP检测技术的发展提供参考。LFD法因为要开盖将试纸条放入终产物中，所以也不能避免开盖污染，而且试纸条造价较高，该方法适于现场检测等开放环境中。芯片法从广义上解决了LAMP多重扩增的问题，但每个芯片各实验组之间容易交叉污染的问题并没有解决。综上所述，发展能够实现多重扩增、低污染率、简便易操作、低成本的检测方法依旧是未来LAMP终产物检测技术的发展方向。

［1］ NOTOMIT，OKAYAMAH，MASUBUCHIH，etal.LoopmediatedisothermalamplificationofDNA［J］.NucleicAcids Research，2000，28（12）：e63.

［2］ NAGAMINEK，HASET，NOTOMIT.Acceleratedreactionby loop-mediatedisothermalamplificationusingloopprimers［J］. MolecularandCellularProbes，2002，16（3）：223-229.

［3］ KAWANOS，MAEDAT，WATANABEJ，etal.Successful diagnosisoftuberculouslymphadenitisbyloop-mediated isothermalamplificationofcutaneoussamplesfromanulcerated surfacelesion：acasereport［J］.JournalofMedicalCase Reports，2014，8：254.

［4］刘威，李环，邹大阳，等.用环介导等温扩增技术快速检测粪便样本中的沙门菌［J］.生物技术通讯，2014，25（2）：237-241.

［5］何晓华，顿玉慧，卢力，等.环介导等温扩增技术在肠杆菌科致病菌检测中的研究进展［J］.食品科学，2014，35（19）：312-317.

［6］李少彤，许少洪，陈宇，等.环介导等温扩增技术在霍乱监测中的应用研究［J］.华南预防医学，2014，40（5）：486-489.

［7］胡兴娟，沈飚，周秀锦，等.水产品中霍乱弧菌可视化环介导等温扩增检测方法的建立及应用［J］.检验检疫学刊，2015（3）：44-47.

［8］戴颖，刘峰涛，何书，等.环介导等温扩增法快速检测手足口病病原体［J］.中国医学创新，2014，11（25）：68-71.

［9］ TSAISS，CHANGYL，HUANGYL，etal.Developmentofa loop-mediatedisothermalamplificationmethodforrapid detectionofpigeoncircovirus［J］.ArchivesofVirology，2014，159（5）：921-926.

［10］ LIC，CHENJ，SHIH，etal.Rapiddetectionofporcine kobuvirusinfecesbyreversetranscriptionloop-mediated isothermalamplification［J］.VirologyJournal，2014，11：73.

［11］ HASIÓW-JAROSZEWSKAB，BUDZYNˊSKAD，BORODYNKO N，etal.Rapiddetectionofgeneticallydiversetomatoblack ringvirusisolatesusingreversetranscriptionloop-mediated isothermalamplification［J］.ArchivesofVirology，2015，160（12）：3075-3078.

［12］柯飞，王赟，胡兴安，等.环介导等温扩增技术及其在水生动物病毒检测中的应用［J］.基因组学与应用生物学，2014，33（4）：935-941.

［13］郭立新，段维军，徐亚飞，等.逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒［J］.植物病理学报，2014，4（4）：349-356.

［14］李东冬，王凯飞，陈荣，等.利用环介导等温扩增技术检测新型隐球菌［J］.中华实验和临床感染病杂志（电子版），2014，8（1）：74-76.

［15］金云云，王静梅，剡根强.基于牛支原体P81基因环介导等温扩增方法的建立及应用［J］.中国兽医学报，2014，34（4）：571-578.

［16］崔淑娟，石伟先，彭晓旻，等.人肺炎衣原体LAMP快速检测方法的建立［J］.中国热带医学，2015，15（8）：917-919.

［17］陈道桢，许飞，葛海燕，等.环介导等温扩增检测弓形虫方法的建立［J］.中国实验诊断学，2011，15（10）：1712-1715.

［18］邝筱珊，胡松楠，游淑珠，等.食品和饲料中转基因植物FMV35S启动子环介导等温扩增检测方法的建立［J］.安徽农业科学，2014，42（16）：4999-5017.

［19］邢宇俊，吴季荣，徐剑宏，等.环介导等温扩增技术检测转基因组分的研究进展［J］.食品安全质量检测学报，2014，5（3）：853-860.

［20］徐凌，殷建华，朱秀，等.胃癌相关基因Serpine1的RTLAMP快速检测法［J］.安徽医科大学学报，2007，42（6）：695-697.

［21］潘宏，段亚萍，李敏玲，等.LAMP法在水牛早期胚胎性别鉴定中的应用［J］.南方农业学报，2015，46（6）：1106-1110.

［22］王丽彬，孟玲.应用环介导等温扩增法进行卡马西平安全用药监测［J］.中国现代应用药学，2014，31（5）：574-577.

［23］张舒亚，张坤，樊彦莉，等.食品过敏原羽扇豆成分的环介导等温扩增检测方法［J］.食品安全质量检测学报，2014，5（4）：1073-1080.

［24］余澍琼，张吉红，崔俊霞，等.利用环介导等温扩增技术检测茶叶中掺杂的大豆成分［J］.浙江农业学报，2015，27（8）：1479-1483.

［25］葛以跃，赵康辰，崔仑标，等.基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立［J］.江苏预防医学，2014，25（4）：1-4.

［26］ TAOZY，ZHOUHY，XIAH，etal.Adaptationofa visualizedloop-mediatedisothermalamplificationtechniquefor fielddetectionofPlasmodiumvivaxinfection［J］.Parasites& Vectors，2011，4（1）：287-290.

［27］江再茂，马雪萍，殷竹君，等.单管可视化环介导等温扩增技术快速检测恶性疟原虫［J］.现代生物医学进展，2014，14（26）：5014-5018.

［28］张永乐，厉小玉，潘克女，等.环介导等温扩增快速检测HIV-1DNA病毒［J］.中华全科医学，2014，12（4）：615-616.

［29］陈永翠，刘嫒，鲜思美，等.改良环介导等温扩增技术在病原检测中的应用［J］.贵州畜牧兽医，2015，39（4）：21-26.

［30］ NORIHIROT，YASUYOSHIM，HIDETOSHIK，etal.Loopmediatedisothermalamplification（LAMP）ofgenesequences andsimplevisualdetectionofproducts［J］.NatureProtocols，2008，3（5）：877-882.

［31］ WONGJKF，YIPSP，LEETMH.Ultrasensitiveand closed-tubecolorimetricloop-mediatedisothermalamplification assayusingcarboxyl-modifiedgoldnanoparticles［J］.Small，2014，10（8）：1495-1499.

［32］ GOTOM，HONDAE，OGURAA，etal.Colorimetric detectionofloopmediatedisothermalamplificationreactionby usinghydroxynaphtholblue［J］.Biotechniques，2009，46（3）：167-172.

［33］王德国.核酸等温扩增产物的可视化检测方法：中国，201210380093.6［P］.2014-04-16.

［34］王瑞娜，周前进，陈炯.环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究［J］.中国兽医学报，2014，34（10）：1615-1633.

［35］管潇，张梦军，韩清娟，等.微流控LAMP芯片构建及在MRSA快速检测中的应用研究［J］.中国测试，2015，41（4）：50-54.

［36］方雪恩.微流控LAMP芯片的研究及在生物分子床边快速检测中的应用［D］.上海：复旦大学，2012.

［37］ ZHANGZ，WANGB，HUS，etal.DetectionofAleutian diseasevirusbyloop-mediatedisothermalamplification［J］. VirusDisease，2015，26（3）：203-206.

（责任编辑：张韵）

Q78

0528-9017（2016）05-0725-05

2016-02-02

浙江省公益性项目（2014C22001，2015C32063）；浙江省自然科学基金项目（LY15C200011）

付振芳（1990—），女，河北邯郸人，硕士研究生，研究方向为转基因检测技术，E-mail：frace7@sina.com。

李玥莹（1966—），女，辽宁大连人，教授，博士，硕士研究生导师，研究方向为分子进化与分子生物学，E-mail：yueyinglicn@yahoo.com.cn。