手术联合化疗对膀胱癌患者外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数的影响

陈定义，胡红林，习小庆，冯燕，占会元，叶真逢

（1南昌大学第二附属医院，南昌330006；2南昌大学第四附属医院；3南昌县人民医院）

手术联合化疗对膀胱癌患者外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数的影响

陈定义1，胡红林1，习小庆1，冯燕2，占会元3，叶真逢1

（1南昌大学第二附属医院，南昌330006；2南昌大学第四附属医院；3南昌县人民医院）

目的 探讨经尿道手术联合表柔比星膀胱灌注化疗对浅表性膀胱癌患者外周血CD4+CD25+CD127low／-调节性T细胞（Treg）计数的影响。方法 选择浅表性膀胱癌患者58例作为观察组（仅行手术治疗9例、行手术+化疗治疗49例）、20例健康体检者作为对照组，采用三色免疫荧光标记法及流式细胞术检测两组外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数。结果 与对照组比较，术前观察组外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数升高（P＜0.05）。与术前比较，术后第1天、1周观察组外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数降低（P均＜0.05），且手术+化疗患者降低更明显（P均＜0.05）。结论 浅表性膀胱癌患者外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数升高，经尿道手术联合表柔比星膀胱灌注化疗可降低其计数。

膀胱肿瘤；调节性T细胞；经尿道手术；表柔比星；膀胱灌注；化学疗法

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤［1］，其主要病理分型为浅表性肿瘤和浸润性肿瘤［2］。浅表性膀胱癌也称为非肌层浸润性膀胱癌，占膀胱移行细胞癌的70%左右，肿瘤细胞和间质未侵犯肌层。近年来研究表明，恶性肿瘤患者存在一定程度的免疫功能异常［3］。调节性T细胞（Treg）是近年来发现的在免疫系统中具有调节功能的一群细胞，具有免疫无能性及免疫抑制性，在肿瘤发生发展方面表现为免疫耐受特性。本研究通过检测浅表性膀胱癌患者外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数，探讨经尿道手术联合表柔比星膀胱腔内灌注化疗对其计数的影响。

1　资料与方法

1.1临床资料 2014年2月～2015年1月于南昌大学第二附属医院泌尿外科住院的浅表性膀胱癌患者58例（观察组），均经手术或术前膀胱镜活检确诊。纳入标准：术前相关检查无盆腔内淋巴结肿大及局部浸润转移，无远处转移。其中男45例、女13

例，年龄28～82（61.4±12.2）岁。其中仅行手术（经尿道膀胱肿瘤电切术）治疗9例、行手术+化疗（术后24 h内、1周给予表柔比星50 mg膀胱灌注化疗）49例，二者性别、年龄比较差异无统计学意义。同时选择于南昌大学第二附属医院体检健康者20例（对照组），男13例、女7例，年龄23～79（59.6± 11.7）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义。本研究经南昌大学第二附属医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg检测 采用三色免疫荧光标记法及流式细胞术。观察组于术前及术后第1天、1周，对照组于体检时抽取清晨空腹肘静脉血3 mL置于EDTA抗凝管，每份血液样本分为实验组及同型对照组。向实验组和同型对照组流式管内各加入FITC标记的鼠抗人CD4单克隆抗体5 μL，再向实验组分别加入APC标记的鼠抗人CD25单克隆抗体5 μL和PE标记的鼠抗人CD127单克隆抗体5 μL，向同型对照组分别加入APC、PE所标记的鼠抗人免疫球蛋白各5 μL。分别向实验组及同型对照组加入同一血液标本各100 μL。混匀，避光反应15 min。向实验组及同型对照组加入1×红细胞裂解液1 000 μL，混匀，再放于避光溶血10 min，以1 500 r／min离心5 min，去掉上清液，分别加入PBS缓冲液300 μL，再次1 500 r／min离心5 min，去掉上清液；加入PBS缓冲液300 μL，用流式细胞仪检测，以CD4+CD25+CD127low／-Treg与CD4+T细胞的比值作为CD4+CD25+CD127low／-Treg的计数。检测时先根据前向角和侧向角散射光信号，对淋巴细胞群进行设门，每次获取设门内细胞10 000个以上。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料用±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

与对照组比较，术前观察组外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数升高（P＜0.05）。与术前比较，术后第1天、1周观察组外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数降低（P均＜0.05），且手术+化疗患者降低更明显（P均＜0.05）。见表1。

表1　两组外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数（±s）

表1　两组外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg计数（±s）

组别nCD4+CD25+CD127low／-Treg 计数术前术后第1天术后1周对照组200.053 4±0.013 1观察组58仅手术90.122 5±0.022 60.097 9±0.013 80.095 6±0.015 5手术+化疗490.119 3±0.021 80.085 4±0.012 70.082 3±0.014 1

3　讨论

1995年Sakaguchi等［4］第一次提出CD4+Treg概念，并同时在小鼠模型中证实了其能够预防机体自身免疫性疾病。有研究［5］也阐释了Treg在维持机体对自身抗原免疫耐受方面起重要作用。人类机体内CD4+CD25+CD127low／-Treg是非常重要的免疫调节性细胞，能够利用其免疫抑制功能来阻止多数免疫细胞激活［6］。Treg介导的免疫调节功能非常复杂，同时被看作是一种多因素参与的反应现象［7］。Treg功能增强或数量增加可促进肿瘤发展，其功能减弱及数量减少则可能发生自身免疫性疾病，维持Treg的动态平衡才能保证机体的正常运行。既往研究表明，一些恶性肿瘤患者外周血Treg计数升高，例如前列腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌及乳腺癌患者［8］。Loskog等［9］报道表明，膀胱癌组织中Treg计数明显增多。Zhu等［10］研究证实，同健康对照组相比，膀胱尿路上皮癌患者外周血及肿瘤组织内Treg计数增多，且CD4+T细胞中Treg总量明显提升。本研究结果显示，膀胱癌患者外周血Treg计数较对照组增多，可见患者机体抗肿瘤免疫功能受到明显抑制。

手术及化疗为目前恶性肿瘤比较有效的治疗措施。手术能够切除原发及转移肿瘤组织，使用药物化学治疗能够有效消除残余癌细胞，两者都能很好地解除肿瘤负荷对机体免疫功能的抑制作用，降低肿瘤复发、浸润转移，从而提升肿瘤治愈率及患者总体生存时间。有研究发现，膀胱癌患者术后Treg计数较术前明显降低，监测到免疫系统在术后24～48 h明显恢复［10］。表明，手术能提高机体免疫功能。本研究结果也提示，观察组患者术后第1天、1周外周血CD4+CD25+CD127low／-Treg／CD4+T计数较术前降低，由Treg介导的抗肿瘤免疫抑制作用可能降低，患者免疫系统部分功能有所恢复，但Treg计数仍高于对照组。研究认为，表柔比星在抗肿瘤方面具有明显效果，当浅表性膀胱肿瘤在行经尿道膀胱肿瘤切除术后联合表柔比星进行膀胱腔内灌注局部化疗，可以降低膀胱肿瘤的复发率［11］。本研究术后联合表柔比星即刻膀胱灌注化疗后外周血Treg计数较对照组低，表明表柔比星能够降低膀胱癌患者外周血Treg计数，从而降低Treg介导的抗肿瘤免疫抑制作用，促进机体的免疫功能恢复。根据以上结果得知总行表柔比星膀胱灌注化疗是膀胱癌患者术后一种非常有效的联合治疗方法，提高患者机体抗肿瘤的免疫功能，减少术后肿瘤的复发，改善预后。

［1］郝捷，陈万青.膀胱癌——2012年中国肿瘤登记年报［M］.北京：军事医学科学出版社，2012：97.

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［3］黄晋生，刘为纹，房殿春，等.肿瘤病人若干免疫功能的观察［J］.海军总医院院刊，1994，7（3）：145-147.

［4］Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains（CD25）.Breakdown of a sigle mechanism of self-tolerance causes various autoimmune disease［J］.J Immunol，1995，115（7）：3808-3821.

［5］Shevach EM.Certified professionals：CD4+CD25+suppressor T cells［J］.J Exp Med，2001，193（11）：F41-F46.

［6］Walter GJ，Evans HG，Menon B，et al.Interaction with activated monocytes enhances cytokine expression and suppressive activity of human CD4+CD45RO+CD25+CD127（low）tegulatory T Cells［J］.Arthritis Rheum，2012，65（3）：627-638.

［7］Hein F，Massin F，Cravoisy-Popovic A，et al.The relationship between CD4+CD25+CD127-regulatory T cells and inflammatory response and outcome during shock states［J］.Critical Care，2010，14（1）：1-11.

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［10］Zhu X，Ma LL，Ye T.Expression of CD4+CD25highCD127low／-regulatory T cells in transitional cell carcinoma patients and its significanc［J］.J Clin Lab Anal，2009，23（4）：197-201.

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.017

R737.14

B

1002-266X（2016）21-0045-02

江西省卫生厅科技计划项目（20143098）。

胡红林（E-mail：honglinhu＠126.com）

（2015-11-14）