西沙必利灌胃对氯吡格雷致大鼠胃黏膜损伤的干预作用及机制

张静，陶磊，张子轩，荣峰

（1安徽医科大学附属六安医院，安徽六安237005；2皖西卫生职业学院）

西沙必利灌胃对氯吡格雷致大鼠胃黏膜损伤的干预作用及机制

张静1，陶磊2，张子轩2，荣峰2

（1安徽医科大学附属六安医院，安徽六安237005；2皖西卫生职业学院）

目的 观察氯吡格雷对大鼠胃黏膜的损伤作用，并探讨西沙必利对黏膜损伤的影响及机制。方法 选取胃溃疡模型制作后溃疡完全愈合大鼠48只，随机分为对照组、氯吡格雷组、西沙必利0.5 mg／kg组、西沙必利0.75 mg／kg组，每组12只。西沙必利两组分别给予0.5、0.75 mg／kg西沙必利灌胃，1 h后与氯吡格雷组大鼠同时再予8.0 mg／kg氯吡格雷灌胃，之后禁食6 h；对照组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，连续灌胃30 d。观察胃黏膜的病理变化，计算溃疡复发率、胃黏膜损伤指数评分和上皮细胞凋亡率；Western blotting法检测胃黏膜组织Caspase-3、NF-κB、Occludin、ZO-1、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表达。结果 与对照组比较，氯吡格雷组溃疡复发率、胃黏膜损伤指数评分和上皮细胞凋亡率升高，Caspase-3、NF-κB、p-p38、p-ERK蛋白表达水平上调，Occludin、ZO-1表达水平下降，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。与氯吡格雷组比较，西沙必利两组溃疡复发率、胃黏膜损伤指数评分和上皮细胞凋亡率降低，Caspase-3、NF-κB、p-p38、p-ERK蛋白表达水平下调，Occludin、ZO-1表达水平上升，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论 氯吡格雷可致大鼠胃黏膜损伤，西沙必利可抵抗该损伤，其机制可能与p38、ERK蛋白的磷酸化有关。

胃溃疡；西沙必利；氯吡格雷；紧密连接蛋白；细胞凋亡

氯吡格雷属于抗血小板药物，临床广泛用于治疗缺血性心脑血管疾病，但其引发的胃肠道损伤不良反应发生率较高［1，2］。目前，临床常联合使用质子泵抑制剂预防氯吡格雷引发的胃肠道损伤，但质子泵抑制剂会增加急性冠状动脉综合征患者死亡的危险［3，4］。研究报道，非选择性5-羟色胺4（5-HT4）受体激动剂西沙必利具有胃黏膜保护作用，但其具体机制还不明确［5，6］。2014年2月～2015年3月，我们对此问题进行了研究。

1　材料与方法

1.1材料 健康雄性清洁级SD大鼠66只，购自安徽医科大学实验动物中心；Caspase-3、NF-κB抗体购自Abcam公司；ZO-1抗体购自Santa Cruz公司；Occludin、p-p38、p-ERK、p-JNK购自Cell Signal Technology公司；BCA蛋白定量测定试剂盒、ECL发光液购自ThermoFisher Scientific公司；羊抗鼠、羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；氯吡格雷片为赛诺菲（杭州）制药有限公司产品；西沙必利片为浙江京新药业股份有限公司产品；羧甲基纤维素钠购自山东聊城阿华制药有限公司。

1.2胃溃疡模型建立及分组 实验操作遵循《实验动物学》有关规定，实验设计及实施均经过本院动物伦理委员会审核批准。大鼠术前均禁食24 h，乙醚麻醉后开腹，将内径为6 mm的塑料管紧贴于胃体与幽门交界处的浆膜面注入乙酸，25 s后移除，缝合手术切口。胃溃疡模型制作后的第3、15、25天，同一时间点开始禁食24 h，禁食后处死，每次6只，观察溃疡愈合情况及测量溃疡面积。在第26天证实溃疡完全愈合的基础上，将剩余大鼠随机分为对照组、氯吡格雷组、0.5 mg／kg西沙必利组、0.75 mg／kg西沙必利组，每组12只。用0.5%羧甲基纤维素钠分别溶解氯吡格雷和西沙必利。对照组给予0.5%羧甲基纤维素钠（10 mL／kg）灌胃后禁食7 h。氯吡格雷组给予氯吡格雷（8.0 mg／kg）灌胃后禁食7 h。西沙必利预处理组分别先予0.5、0.75 mg／kg西沙必利灌胃，1 h后再予氯吡格雷（8.0 mg／kg）灌胃，之后禁食6 h。连续灌胃30 d，每次灌胃前禁食4 h。给药结束后处死所有大鼠，观察溃疡复发情况，并采集标本进行后续各项指标的检测。

1.3胃黏膜损伤评价 ①溃疡面积测定：沿胃大弯切开胃，用0.9%氯化钠溶液冲洗，将溃疡轮廓描记在透明胶片上，复制到方格纸上，计算面积。②胃黏膜损伤指数评分：斑点样损伤计1分，损伤长度＜1 mm计2分，1～＜2 mm计3分，2～＜4 mm计4分，≥4 mm计5分；若宽度≥2 mm，积分加倍计算。③组织染色观察：胃组织用4%甲醛固定24 h，脱水，透明，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，400倍光学显微镜下观察。④胃黏膜上皮细胞凋亡检测：石蜡切片脱蜡，水化，加蛋白酶37℃消化30 min，加0.3%H2O2-甲醇室温下作用10 min，加0.1%聚乙二醇辛基苯基醚冰上作用2 min，加50 μL反应混合液，37℃孵育60 min，加过氧化物酶于37℃作用30 min，加二氨基联苯胺室温显色10 min，脱水，透明，封固。每例观察5个视野，以每100个细胞中棕黄色阳性细胞所占比例作为凋亡率。

1.4胃黏膜组织中各类蛋白表达检测 取各组大鼠胃黏膜组织，加组织裂解液裂解完全，蛋白样品采用BCA法定量，上样量为30 μg；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离后，恒流转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜，之后加入相应的一抗（1∶1 000）、二抗（1∶5 000）进行孵育并洗膜，ECL发光显影。采用Western blotting法检测胃黏膜组织Caspase-3、NF-κB、Occludin、ZO-1、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表达，计算其相对表达量。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组溃疡愈合情况 乙酸溃疡模型制作后第4、16、26天，各随机选取6只大鼠处死观察，胃溃疡愈合依次为0、3、6只，溃疡面积分别为（20.7± 1.5）、（4.5±0.8）、（0.0±0.0）mm2。

2.2各组给药后溃疡复发、胃黏膜损伤和上皮细胞凋亡情况 氯吡格雷组与0.75 mg／kg西沙必利组各死亡1只。对照组、氯吡格雷组、西沙必利0.5 mg／kg组、西沙必利0.75 mg／kg组溃疡复发率分别为0、36.4%、16.7%、18.2%。与对照组比较，氯吡格雷组胃溃疡复发率升高（P＜0.05）；与氯吡格雷组比较，西沙必利两组胃溃疡复发率均降低（P均＜0.05）。各组胃黏膜损伤和上皮细胞凋亡情况比较见表1。

表1　各组胃黏膜损伤及上皮细胞凋亡情况比较（±s）

表1　各组胃黏膜损伤及上皮细胞凋亡情况比较（±s）

注：与对照组比较，＃P＜0.05；与氯吡格雷组比较，*P＜0.05。

组别n胃黏膜损伤指数评分（分）上皮细胞凋亡率（%）对照组120.00±0.002.16±1.02氯吡格雷组1125.35±3.08＃36.35±6.72＃西沙必利0.5 mg／kg组1213.62±2.13*12.83±2.68*西沙必利0.75 mg／kg组1114.03±2.24*13.54±2.19*

2.3各组胃黏膜组织学变化 对照组大鼠胃腺部黏膜层、黏膜下层、肌层结构完整连续，腺体排列紧密，未见炎性细胞浸润；氯吡格雷组大鼠溃疡呈喷口状，未见深达黏膜肌层，局部可见坏死组织，毛细血管广泛充血扩张，黏膜层和黏膜下层均可见出血，并可见中性粒细胞浸润及水肿改变；西沙必利两组大鼠喷口状坏死灶明显减少、变浅，黏膜下层充血水肿减轻。

2.4各组胃黏膜组织各类蛋白表达 见表2。

表2　各组胃黏膜组织各类蛋白表达比较（±s）

表2　各组胃黏膜组织各类蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，＃P＜0.05；与氯吡格雷组比较，*P＜0.05。

组别nCaspase-3NF-κBOccludinZO-1p-p38p-ERKp-JNK对照组121.01±0.021.00±0.011.020±0.0211.004±0.0301.01±0.021.00±0.031.00±0.03氯吡格雷组112.05±0.24＃1.66±0.13＃0.326±0.005＃0.185±0.006＃1.94±0.15＃1.69±0.12＃1.12±0.02西沙必利0.5 mg／kg组121.26±0.13*1.42±0.11*0.672±0.014*0.364±0.013*1.22±0.09*1.16±0.07*1.21±0.05西沙必利0.75 mg／kg组111.14±0.15*1.03±0.02*0.581±0.012*0.309±0.017*1.28±0.08*1.08±0.04*1.03±0.03

3　讨论

研究表明，既往溃疡病史患者服用氯吡格雷易发生再出血，出血部位多为以往溃疡发生处，内镜下溃疡已愈合者单独服用氯吡格雷6个月后溃疡的复发率达到11.0%［7］。氯吡格雷作为二磷酸腺苷受体拮抗剂，抑制血小板释放内皮增生和加速修复溃疡的血管内皮生长因子，可导致溃疡组织血管生长受抑，从而延迟胃溃疡的修复。氯吡格雷也可抑制人胃黏膜上皮细胞株GES-1的增殖，诱导细胞发生凋亡［8］。半夏泻心汤可通过上调胃黏膜上皮细胞中B细胞淋巴瘤基因-2 mRNA的表达，下调活化的凋亡执行因子Caspase-3表达，从而抑制胃黏膜上皮细胞的过度凋亡发挥胃黏膜抗应激性损伤的作用［9］。本研究结果显示，氯吡格雷使胃溃疡愈合大鼠模型的溃疡复发率上升，胃黏膜损伤指数及胃黏膜上皮细胞凋亡率升高，Caspase-3、NF-κB蛋白表达水平升高。

研究报道，5-HT4受体激动剂西沙比利可增加胃黏膜NO含量，扩张胃黏膜血管，加速损伤炎性因子的排除，抑制血小板聚集，促进HCO3-分泌，发挥胃黏膜的保护作用［5］。张连阳等［6］观察西沙必利对大鼠出血性休克复苏后胃损害的作用，结果显示大鼠胃血流量下降幅度减少，胃黏膜丙二醛含量降低，Na+-K+-三磷酸腺苷酶活性增加，门静脉血乳酸水平下降，西沙必利可有效改善复苏后持续存在的胃缺血缺氧状态。另一种5-HT4受体激动剂莫沙必利可减轻非甾体抗炎药的促溃疡作用，对胃黏膜发挥保护作用［10，11］。本研究结果显示，与氯吡格雷组比较，西沙必利干预后大鼠胃溃疡复发率、胃黏膜损伤指数评分和上皮细胞凋亡率明显减小，Caspase-3、NF-κB蛋白表达水平下调，从而发挥抵抗氯吡格雷所致胃黏膜损伤的作用。

胃肠黏膜上皮屏障功能主要由细胞内紧密连接复合体维持，其中紧密连接蛋白主要包括跨膜蛋白Occludin、胞质附着蛋白ZO-1等［12］。Yang等［13］研究发现，肠黏膜中ZO-1和Occludin蛋白的表达明显降低，肠黏膜通透性增强，导致肠道受损。Wu等［14］研究氯吡格雷对人胃黏膜上皮细胞株GES-1紧密连接蛋白表达的影响，结果显示随着氯吡格雷浓度的增加，ZO-1和Occludin蛋白的表达量呈降低趋势，此过程p38／丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路处于激活状态。MAPK在诱导细胞凋亡、应激及炎症反应调控过程中发挥重要作用，参与调节胃上皮增生、分化、凋亡等过程，且与胃溃疡形成具有紧密关系［15］。人类MAPK信号转导通路主要由ERK、p38、JNK／MAPK这三个家族组成。高欣等［11］研究表明，莫沙必利对阿司匹林致大鼠急性胃黏膜损伤具有明显保护作用，其机制可能为降低MAPKs信号通路中ERK和p38蛋白磷酸化程度，并上调胃黏膜紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达，从而改善胃黏膜屏障的功能。本研究发现，氯吡格雷可下调胃黏膜组织Occludin、ZO-1的表达水平，上调p38、ERK的磷酸化表达水平；经西沙必利干预后，Occludin、ZO-1的表达水平升高，p38、ERK的磷酸化表达水平下降。

综上所述，西沙必利可通过减少胃上皮细胞凋亡、抑制溃疡复发和上调胃黏膜Occludin、ZO-1表达水平，起到抵抗氯吡格雷所致大鼠胃黏膜损伤的作用，机制可能与p38、ERK的磷酸化有关。

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.011

R-332；R573

A

1002-266X（2016）21-0030-03

张静（E-mail：wsry558＠126.com）

（2015-09-08）