四君子汤对肠梗阻解除后大鼠血清DAO及小肠组织MDA、SCF表达的影响

桑伟岗，李琳，解基良

（1天津医科大学，天津300070；2天津市南开医院）

四君子汤对肠梗阻解除后大鼠血清DAO及小肠组织MDA、SCF表达的影响

桑伟岗1，李琳2，解基良2

（1天津医科大学，天津300070；2天津市南开医院）

目的 探讨四君子汤对肠梗阻解除后大鼠血清二胺氧化酶（DAO）及小肠组织丙二醛（MDA）、干细胞因子（SCF）表达的影响。方法 将60只雄性Wistar大鼠随机分为假手术（C）组10只、造模组50只。制作肠梗阻模型后造模组再随机均分为模型（M）组、梗阻解除48 h自然恢复48 h（R1）组、梗阻解除48 h自然恢复96 h（R2）组、梗阻解除48 h四君子汤治疗48 h（S1）组、梗阻解除48 h四君子汤治疗96 h（S2）组。造模组造模48 h解除小肠机械性梗阻。S1、S2组四君子汤灌胃，每次1 mL／100 g，2次／d；C组及R1、R2组给予等体积生理盐水灌胃。各组各自干预后即刻取下腔静脉血分离血清，取梗阻近端小肠组织。采用ELISA法检测血清DAO及小肠组织MDA，采用RT-PCR法检测小肠组织SCF mRNA表达。结果 与M组比较，S1组、S2组血清DAO水平、小肠组织MDA及SCF mRNA表达降低，且S2组小肠组织MDA及SCF mRNA表达降低更明显（P均＜0.05）。结论 肠梗阻解除后大鼠应用四君子汤后血清DAO及小肠组织MDA、SCF表达降低。

肠梗阻；四君子汤；二胺氧化酶；丙二醛；干细胞因子；大鼠

肠梗阻导致肠功能障碍的概率很高，而肠梗阻解除后肠功能并不能立即恢复。肠梗阻导致肠功能障碍可表现在肠屏障功能破坏、营养不良、运动功能障碍等多个方面。肠梗阻解除后同时存在“脾胃虚弱”的表现，本质上属于“本虚标实证”。而四君子汤作为补益脾胃的基础方剂，有调节胃肠功能恢复的作用［1］。2013年10月～2015年10月，本研究以机械性肠梗阻大鼠模型为研究对象，探讨肠梗阻解除后四君子汤对其血清二胺氧化酶（DAO）及小肠组织丙二醛（MDA）、干细胞因子（SCF）表达的影响。

1　材料与方法

1.1动物、试剂及药物 健康雄性Wistar大鼠60只，体质量250～300 g，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境学研究所动物实验中心提供，许可证号：SCXK-（军）2009-003，标准颗粒混合饲料喂养1周。DAO、MDA ELISA试剂盒（BlueGene公司提供）；蛋白定量测试盒（南京建成生物工程研究所提供）；组织总RNA提取试剂盒，RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit，Maxima SYBR Green／Fluorescein qPCR Master Mix（2×）（Thermo Fisher公司）。SCF mRNA引物由上海生工设计、合成。中药煎剂制备：将四君子汤中人参、茯苓、白术、甘草按照3∶3∶3∶2比例配伍，水煎煮，滤药浓缩至1 g／mL，灭菌后4℃保存。

1.2肠梗阻模型制作及分组 参照丝线造模法改良模型［2，3］，具体操作：大鼠术前禁饮食，麻醉满意后，取腹部正中切口（约3 cm），将末端回肠轻缓提出体外，于末端回肠5 cm内无血管区穿过肠系膜，将制作装置固定结扎于此处（头皮针塑料导管长约0.7 cm，7号丝线从导管中间穿过，头皮针型号0.4 ×20TW SB），用导管与肠管接触，从而保护肠管，7号丝线结扎，形成肠梗阻，将肠管还纳入腹腔，关闭腹腔，放回鼠笼，麻醉清醒后继续正常喂养。48 h后再次手术解除肠梗阻，剪断固定装置，关腹。将大鼠随机分为假手术（C）组10只、造模组50只。假手术组开腹方法同模型组但不结扎。造模组造模后48 h，再次手术，沿原手术切口进入，剪断固定装置并小心取下，解除小肠机械性梗阻。造模组再随机均分为模型（M）组、梗阻解除48 h自然恢复48 h（R1）组、梗阻解除48 h自然恢复96 h（R2）组、梗阻解除48 h四君子汤治疗48 h（S1）组、梗阻解除48 h四君子汤治疗96 h（S2）组。S1、S2组四君子汤灌胃，每次1 mL／100 g，2次／d；C组及R1、R2组给予等体积生理盐水灌胃。各组各自干预后以水合氯醛麻醉，沿原手术切口进腹，取下腔静脉血2 mL置于促凝管中，4℃下3 000 r／min离心10 min，取上层血清置于1.5 mL EP管中备用。取梗阻近端小肠10 cm，冲洗干净后研磨，取上清液保存。以上待测标本-80℃存放。

1.3血清DAO、小肠组织MDA检测 按照Blue-Gene公司提供的DAO、MDA试剂盒所示的操作步骤用ELISA法检测血清DAO、小肠组织MDA。

1.4小肠组织SCF mRNA表达检测 采用RTPCR法。SCF上游引物：5′-CATGCTTTAAGGCCTTTGTCACGAG-3′，下游引物5′-GGAGATGGCAGTTGTGCAGCTA-3′；内参Gapdh上游引物：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。各组取20 mg大鼠小肠组织，提取总RNA，总RNA浓度36.7～190.0 ng／μL，然后合成cDNA第1链，按RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit，再行RT-PCR定量检测。反应条件：50℃预处理2 min，95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃延伸60 s，变性和延伸40个循环。采用2-ΔΔCt公式计算基因相对表达量。

1.5统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料用±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

各组血清DAO水平、小肠组织MDA及SCF mRNA表达比较见表1。与C组比较，M组、R1组、R2组血清DAO水平、小肠组织MDA及SCF mRNA表达升高（P均＜0.05）；与M组比较，S1组、S2组血清DAO水平、小肠组织MDA及SCF mRNA表达降低，且S2组小肠组织MDA及SCF mRNA表达降低更明显（P均＜0.05）。

表1　各组血清DAO水平、小肠组织MDA及SCF mRNA表达比较（±s）

表1　各组血清DAO水平、小肠组织MDA及SCF mRNA表达比较（±s）

注：与C组比较，aP＜0.05；与M组比较，bP＜0.05；与R1组比较，cP＜0.05；与R2组比较，dP＜0.05；与S1组比较，eP＜0.05。

组别nDAO（mg／mL）MDA（mg／g蛋白）SCF mRNA C组104.942±0.5600.125±0.01627.387±0.939 M组108.325±1.553a0.234±0.027a10.066±0.585aR1组107.300±0.788ab0.209±0.028b14.118±0.601abR2组106.156±0.934abc0.176±0.022abc19.649±4.056abcS1组106.070±1.042bc0.171±0.018abc17.225±2.936abcS2组105.008±0.759bcd0.124±0.019bcde23.998±3.043bcde

3　讨论

肠梗阻是临床常见的导致肠功能障碍的病因之一。治疗肠功能障碍的中医方法很多，包括通里攻下法、活血化瘀法、清热解毒法、健脾和胃法等，并获得一定疗效，其中以通里攻下法应用最为广泛。目前国内研究已经证实，通里攻下法对于急腹症具有多层面、多靶点的治疗作用，但不足之处在于缺乏严格的中医辨证，因肠功能障碍不一定都属于“里实热证”。以往研究发现，肠梗阻解除后同时存在“脾胃虚弱”的表现，本质上属于“本虚标实证”。李芳等［4］对81例脓毒症的中医证候进行分析，结果显示肠功能障碍属于虚实夹杂证，虚证占很大比例，而且预后更差。现代药理研究提示，四君子汤可影响胃肠活动［5］，具有双向调节胃肠道运动的作用［1，6，7］。四君子汤作为治疗脾胃虚弱的基础方剂，通过补益脾胃运湿健脾，促进脾运化功能的恢复，使水湿不致停滞于肠道，恢复肠道的运动功能。

DAO是哺乳动物小肠黏膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，能较理想地反映小肠黏膜的结构和功能［8］，但在病理状态下如机械性肠梗阻时肠黏膜细胞缺血受损，肠黏膜细胞内DAO释放入血，致血清DAO升高，可见血清DAO水平能反映小肠黏膜的损伤情况及功能紊乱情况，间接反映肠功能障碍。MDA作为脂质过氧化物的代表，机体缺血缺氧时产生自由基的多少与MDA水平呈正相关，反映了氧自由基对细胞损伤的程度，它的产生能加剧黏膜的损伤，破坏细胞骨架，最终导致肠屏障的损害，细菌移位。因此可通过MDA了解脂质过氧化程度，以间接反映大鼠小肠黏膜的损伤损伤程度及肠功能。有研究结果显示，四君子汤有利于巨结肠患儿的肠黏膜结构及屏障功能恢复［9］。李琳［10］对大耳白兔的实验研究发现，四君子汤对肠黏膜屏障有保护作用。本研究通过测定DAO、MDA肠黏膜屏障功能损伤指标也发现，四君子汤有利于大鼠肠梗阻解除后肠黏膜结构和功能的恢复。

肠梗阻虽然可解除，但是机体仍然存在肠功能障碍，且肠运动功能障碍是其中一个重要的临床表现。目前普遍认为胃肠道神经（ENS）-Cajal间质细胞（ICC）-平滑肌网络结构可调节胃肠道运动。ICC被认为是胃肠道动力的“起搏细胞”及神经信号传导的“中介细胞”，在胃肠道动力调节的诸多因素中，对胃肠动力的形成和调节起关键性作用［11，12］。酪胺酸激酶受体（c-Kit）是ICC的特异性标志物，SCF是c-Kit的天然配体，SCF与c-Kit结合后所启动的信号通路，对ICC的增殖、分化及表型维持至关重要［13，14］。有研究显示，c-Kit、SCF基因异常表达及相应的信号通路受损可引起ICC表型发生转化，导致形态和功能异常。微环境中SCF水平对ICC的培养至关重要，ICC的培养必须依赖SCF才能成活，不加SCF的培养基ICC基本不能存活。这些研究结果说明正常的SCF／c-Kit信号通路对ICC表型维持和生理功能的实现具有不可替代的作用，而c-Kit和SCF基因的正常表达是维持这一信号通路的必要条件。研究发现，ICC与许多胃肠动力障碍性疾病有关。先天性巨结肠是以肠内容物排出受阻为特征的一种先天性肠道动力障碍性疾病，越来越多的学者认识到先天性巨结肠肠运动功能障碍与ICC分布、数量及功能异常有关［15］。本研究中大鼠肠梗阻解除后应用四君子汤治疗，SCF mRNA水平明显升高，提示四君子汤对大鼠肠梗阻解除后肠运动功能恢复有利。

［1］潘程程，李岩.四君子汤及其活性物质对胃肠动力作用的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2014，22（25）：3786-3790.

［2］El-Awady SI，El-Nagar M，El-Dakar M，et al.Bacterial translocation in an experimental intestinal obstruction model［J］.Acta Cir Bras，2009，24（2）：98-106.

［3］李禹呈，杨拯，袁梦郎，等.新方法建立大鼠不完全性肠梗阻模型的实验研究［J］.四川动物，2013，32（2）：276-279.

［4］李芳，梁旭.脓毒症肠功能障碍与中医虚实证候及预后相关性的回顾性研究［J］.辽宁中医杂志，2011，38（8）：1566-1568.

［5］叶富强，陈蔚文，李茹柳，等.四君子汤提取物对大鼠胃肠活动的影响［J］.中药药理与临床，2002，18（3）：2-4.

［6］王汝俊，胡英杰，杜群，等.四君子汤对胃肠运动双向调节作用的物质基础研究（Ⅰ）［J］.中药药理与临床，2001，17（6）：3-4.

［7］张曼，陈蔚文，叶富强，等.四君子汤A、B成分双向调节大鼠胃运动的M受体作用机制［J］.河南中医药学刊，2002，17（4）：9-11.

［8］Bragg LE，Thompson JS，West WW.Intestinal diamine oxidase levels reflect ischemic injury［J］.Surg Res，1991，50（3）：228-233.

［9］Zhu Y，Yao MH，Wang X.Clinical observation of effects of Modified Sijunzi Decoction on the intestinal mucosal barrier of giant colon children patients［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2012，32（2）：199-202.

［10］李琳.四君子汤对肠梗阻解除后肠黏膜屏障功能影响的实验研究［J］.天津中医药，2015，32（6）：56-58.

［11］Huizinga JD，Chen JH.Interstitial cells of Cajal：update on basic and clinical science［J］.Curr Gastroenterol Rep，2014，16（1）：363.

［12］Sanders KM.Interstitial cells of Cajal at the clinical and scientific interface［J］.Physiol，2006，576（3）：683-687.

［13］Hirota S，Isozaki K，Nishida T，et al.Effects of loss-of-function and gain-of-function mutations of c-kit on the gastrointestinal tract［J］.J Gastroenterol，2000，35（12）：75-79.

［14］Abramovic M，Radenkovic G，Velickov A.Appearance of interstitial cells of Cajal in the human midgut［J］.Cell Tissue Res，2014，356（1）：9-14.

［15］Lemos SP，Martins JL，Lemos PV，et al.Abnormalities of digestive tract innervation in rat fetus treated with ethylenethiourea［J］.Acta Cir Bras，2012，27（3）：244-250.

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.013

R332；R574.2

A

1002-266X（2016）21-0035-03

天津市中医药管理局中医中西医结合科研课题（13501）。

解基良（E-mail：Xie.j.l＠163.com）

（2015-10-24）