CAFs及IL-8对裸鼠人卵巢癌移植瘤生长的影响

李猛，杨璐璐，陈琢，陈颖

（1中国医科大学附属第四医院，沈阳110032；2中国医科大学；3沈阳医学院）

·基础研究·

CAFs及IL-8对裸鼠人卵巢癌移植瘤生长的影响

李猛1，杨璐璐2，陈琢3，陈颖1

（1中国医科大学附属第四医院，沈阳110032；2中国医科大学；3沈阳医学院）

目的 探讨癌相关成纤维细胞（CAFs）及白细胞介素8（IL-8）对裸鼠卵巢癌生长的促进作用。方法CAFs和成纤维细胞（NFs）原代培养并鉴定，培养人卵巢癌细胞株（OVCAR3细胞）。将10只裸鼠随机分为10组，分别接种NFs、CAFs、OVCAR3、NFs+OVCAR3、CAFs+OVCAR3及IL-8（100 ng／mL）干预后的以上细胞，并根据相应接种细胞分组，建立裸鼠皮下移植瘤模型。观察各组成瘤情况，计算肿瘤体积；处死裸鼠，剥离瘤体，HE染色后镜下观察裸鼠荷瘤组织病理变化。结果 NFs组、CAFs组、NFs+OVCAR3组、CAFs+IL-8组、NFs+IL-8组、NFs+ OVCAR3+IL-8组未见肿瘤生长。OVCAR3+CAFs+IL-8组、OVCAR3+CAFs组、OVCAR3+IL-8组成瘤体积明显大于OVCAR3组（P均＜0.05），在前期OVCAR3+CAFs+IL-8组成瘤体积最大（P均＜0.05）。HE染色镜下见OVCAR3+CAFs+IL-8组癌组织恶性程度最高。结论 CAFs、IL-8能在体内促进裸鼠卵巢癌移植瘤的生长，且二者有协同作用。

卵巢肿瘤；癌相关成纤维细胞；白细胞介素8；小鼠

近年来研究证明，卵巢癌的发生、发展及转移与肿瘤微环境、慢性炎症有密切关系［1，2］。卵巢癌微环境中癌相关成纤维细胞（CAFs）能分泌多种因子促进肿瘤血管、淋巴管生成，促进肿瘤的侵袭和远处转移［3］。慢性炎症的长期刺激可诱发人正常细胞增殖、突变、阻止细胞凋亡并且导致细胞恶变［4］，还能通过诱导浸润在肿瘤微环境的细胞分泌细胞因子和趋化因子等增加患癌风险。白细胞介素8（IL-8）可通过促进肿瘤细胞的增殖、转移和血管生成来促进卵巢癌的进展［5］。但目前关于肿瘤微环境、慢性炎症导致卵巢癌发生发展的具体机制仍不清楚。本研究于2015年6～11月通过建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型，探讨CAFs及IL-8对卵巢癌成瘤的作用。

1　材料与方法

1.1材料 人卵巢癌细胞株OVCAR3（中国医科大学赠送）；DMEM培养基、RPMI1640培养基、青链霉素（Hyclone公司），磷酸盐缓冲液（PBS）、IL-8（中杉金桥），胰蛋白酶、胎牛血清（天津灏洋公司），二甲基亚砜（Sigma公司）；BALB／C-nu雌性裸鼠10只（北京华阜康），4～5周龄，体质量14～16 g，按三级动物要求由中国医科大学动物实验中心在SPF环境中饲养。

1.2CAFs、成纤维细胞（NFs）提取及鉴定 无菌条件下取卵巢癌组织标本3例、宫颈癌根治术中正常卵巢组织标本3例。取上皮性卵巢癌组织，反复清洗，修剪，剪碎，置于培养瓶中培养，传至3代进行CAFs免疫组化鉴别。从正常卵巢组织提取并培养NFs，鉴别同CAFs。将胞质中出现淡棕色或棕黄色颗粒判为阳性染色。CAFs细胞的波形蛋白和α-SMA均为阳性表达，胞质呈黄棕色着色，角蛋白呈阴性表达。NFs细胞的波形蛋白为阳性表达，胞质呈黄棕色着色，α-SMA与细胞角蛋白均为阴性表达。

1.3OVCAR3、CAFs、NFs培养 于37℃、5%CO2条件下，用含10%胎牛血清的DMEM培养CAFs和NFs，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养OVCAR3。待OVCAR3、CAFs和NFs生长至70%～80%，取部分OVCAR3、CAFs、NFs用含IL-8（100 ng／mL）培养基培养24 h。将细胞进行计数，根据计数用PBS将各类细胞分别配制成终浓度为2×107／mL、4×107／mL。再按1∶1比例将浓度为2×107／mL的细胞分别混合制成OVCAR3+CAFs、NFs+ OVCAR3、OVCAR3+CAFs+IL-8、NFs+OVCAR3+ IL-8细胞混悬液（终浓度4×107／mL）。1.4 裸鼠皮下移植瘤模型建立 将10只裸鼠随机分为10组，分别接种NFs、CAFs、OVCAR3、NFs+ OVCAR3、CAFs+OVCAR3及IL-8干预后的以上细胞。每只裸鼠分别取3处接种细胞，将裸鼠双前肢腋窝皮下和后背作为接种点，每处接种0.15 mL，注射后用镊子夹闭针孔，观察成瘤情况。当肿瘤长至0.3 cm×0.3 cm时，记录测量肿瘤最大径线（a）、与最大径线垂直的最长径线（b），计算肿瘤体积（V＝1／6πab2）（mm3）。观察肿瘤，待肿瘤表面破溃时处死裸鼠，剥离瘤体，一部分立即放入-80℃冰箱保

存，另一部分用甲醛固定后石蜡包埋，保存。HE染色后观察裸鼠荷瘤组织病理变化。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料用±s表示，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CAFs和IL-8对裸鼠移植瘤生长的影响 NFs组、CAFs组、NFs+OVCAR3组、CAFs+IL-8组、NFs +IL-8组、NFs+OVCAR3+IL-8组未见肿瘤生长。其余各组肿瘤体积生长变化见表1。

表1　各组不同时点肿瘤体积比较（mm3，±s）

表1　各组不同时点肿瘤体积比较（mm3，±s）

注：与OVCAR3组比较，aP＜0.05；与OVCAR3+IL-8组比较，bP＜0.05；与CAFs+OVCAR3组比较，cP＜0.05。

组别肿瘤体积接种第17天接种第19天接种第21天接种第23天接种第25天OVCAR3组16.21±1.4319.35±1.2223.50±2.74106.96±11.82163.15±1.85 OVCAR3+IL-8组46.93±6.93a59.82±7.10a92.85±10.67a131.57±15.48a170.66±4.49aCAFs+OVCAR3组67.25±8.75ab100.46±14.94ab147.70±16.04ab219.37±21.98ab282.78±54.94abCAFs+OVCAR3+IL-8组63.54±11.74abc75.38±17.59abc135.74±21.97ab187.93±39.35ac241.15±79.39ac

2.2裸鼠成瘤组织的病理变化 裸鼠成瘤组织HE染色镜下见OVCAR3+CAFs+IL-8组癌组织恶性程度最高（经中国医科大学附属第四医院病理科证实）。

3　讨论

肿瘤微环境是近年来肿瘤课题研究的热点，肿瘤细胞与肿瘤微环境是一个不可分割的整体，它们之间的功能互动性已经得到了普遍的认可，肿瘤基质在肿瘤的发展、增殖及浸润等进程中起到了“土壤”的作用［6］。在卵巢癌肿瘤微环境中，CAFs的数量远远大于卵巢良性肿瘤和交界性肿瘤（P＜0.01），而且CAFs数量增加与卵巢癌患者出现淋巴结转移和大网膜转移以及淋巴管密度和肿瘤微血管密度增加有关［7］。研究发现，CAFs能通过分泌组蛋白甲基化转移酶、血管内皮生长因子、趋化因子等促进肿瘤血管生成、淋巴管生成和肿瘤细胞的侵袭力来协同促进肿瘤发展及浸润［7，8］。本实验中，CAFs+ OVCAR3组裸鼠皮下成瘤体积明显高于OVCAR3组，表明CAFs能明显促进卵巢癌组织的增殖，这与以往文献［8］报道一致。肿瘤细胞周围的NFs可受到癌细胞分泌多种因子的影响，进入活化状态［1，9，10］。在本实验中，NFs+OVCAR3组在裸鼠皮下未见肿瘤生长，说明正常NFs对肿瘤无促进作用，这与NFs低表达或不表达成纤维细胞活化蛋白（FAP）、IL-8、转化生长因子β（TGF-β）、HGF等有关［2］，而NFs转化为活化NFs的机制有待进一步研究。

持续、慢性的炎症环境能促进细胞转化，导致组织损伤并引起修复反应，包括分泌生长因子、组织重建的酶类、免疫调节因子等，但慢性炎症环境中所含的炎症细胞、细胞因子及趋化因子等也可诱发人正常细胞增殖、突变，阻止细胞凋亡甚至恶变，并且能促进肿瘤细胞的生长、扩散、浸润［4，11］。炎症环境中的趋化因子参与许多肿瘤的生长过程，如卵巢癌、乳腺癌和结肠癌等［12］，但趋化因子和趋化因子受体调节恶性疾病的发生及进展的具体机制目前不清楚。IL-8是CAFs分泌的趋化因子之一，有文献证明IL-8浓度为100 ng／mL时对肿瘤促进作用最明显［13］。在本实验中，OVCAR3+IL-8组裸鼠成瘤体积明显大于OVCAR3组，表明IL-8能明显促进卵巢癌细胞的增殖。本实验中OVCAR3+NFs+IL-8组未见明确的肿瘤形成，这与以往文献报道相异［10，15］，可能与本实验中IL-8未能将NFs激活，也可能与NFs对肿瘤细胞有直接接触抑制作用有关，其机制有待进一步研究。

CAFs在肿瘤的形成过程中分泌了IL-6、FAP、TGF-β、肝细胞生长因子、表皮生长因子等多种炎性因子和趋化因子，它们在肿瘤微环境中共同组成炎症环境促进肿瘤的生长［1，11］。在本实验中，OVCAR3+IL-8组裸鼠成瘤体积大于OVCAR3组，而OVCAR3+IL-8+CAFs组裸鼠成瘤体积最大，说明IL-8和CAFs协同作用促进了卵巢癌细胞的生长；根据瘤组织HE染色提示，IL-8+OVCAR3+CAFs组的瘤细胞恶性程度最高，由此我们推测IL-8可能成为预测卵巢癌的恶性程度及预后的指标之一。

综上所述，CAFs和IL-8在卵巢癌增殖过程中发挥重要作用，未来或许通过抑制其产生或转变来抑制卵巢癌的发展，成为卵巢癌治疗的分子靶点；IL-8可能成为卵巢癌预后的判断指标之一。但CAFs和IL-8对卵巢癌发生、侵袭及浸润的作用机制目前仍不明确，尚需进一步研究。

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.009

R-332；R737.31

A

1002-266X（2016）21-0025-03

辽宁省科学技术计划项目（2013225021）；辽宁省“百千万人才工程”资助项目（2012921031）。

陈颖（E-mail：chenying718＠tom.com）

（2015-12-30）