咳喘宁对RSV诱发哮喘大鼠血清IL-4、IFN-γ的调节作用及对支气管平滑肌增殖活性的影响

谭维，李英*，罗银河，王孟清，舒兰，唐力琼，龚细妹，李平，陶洪，彭昕欣

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

·方药研究·

咳喘宁对RSV诱发哮喘大鼠血清IL-4、IFN-γ的调节作用及对支气管平滑肌增殖活性的影响

谭维1，李英2*，罗银河2，王孟清2，舒兰2，唐力琼1，龚细妹1，李平1，陶洪2，彭昕欣2

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

目的观察咳喘宁对RSV诱发哮喘大鼠血清IL-4、IFN-γ的调节作用及对气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)增殖水平（OD值）的影响。方法将60只大鼠随机分为6组，除正常组外，其余大鼠通过致敏、诱喘、病毒激发哮喘进行造模。造模完成当天分组干预,并用ELISA进行IL-4、IFN-γ水平的测定。造模成功后取支气管平滑肌进行细胞培养，倒置显微镜下化学荧光法鉴定为平滑肌细胞。制备大鼠不同组含药血清并加入第3-7代ASMCs中干预。运用MTT法检测各组ASMCs增殖水平（OD值）。结果ELISA法结果，与模型组相比，西药治疗组、咳喘宁各剂量组血清IL-4、IFN-γ水平差异具有统计学意义（P＜0.05）；与咳喘宁大、小剂量组相比，中剂量组血清IL-4、IFN-γ水平差异有统计学意义（P＜0.05）。MTT法结果，与空白对照组比较，其余5组差异均有显著统计学意义（P＜0.01）；与咳喘宁大、小剂量血清中比较，中剂量血清组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论咳喘宁对治疗RSV诱发的哮喘大鼠疗效较为显著，通过上调IFN-r水平、降低IL-4水平表达从而降低气道炎症反应，维持Th1/Th2平衡来调节机体免疫机制。咳喘宁治疗支气管哮喘可能与其能够抑制气道平滑肌增殖、影响哮喘气道重塑关系密切。

咳喘宁；哮喘；白介素-4；干扰素-γ；气道平滑肌细胞

支气管哮喘简称哮喘(asthma)，是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病［1］，也是儿童时期常见的呼吸道变应性炎症疾病［2］。在诸多致哮喘病因中，病毒感染是诱发儿童哮喘最常见的原因，有研究显示［3]，85%的儿童哮喘急性发作与病毒感染有关，呼吸道合胞病毒（RSV）感染所致者可高达78.49%，是儿童哮喘急性发作时的主要病原体［4］。病毒也是引起哮喘急性加重与恶化的重要因素，且参与所有年龄的哮喘加重［5]。气道重塑能够引起气道不可逆狭窄和气道持续高反应性，成为气流不可逆阻塞和哮喘反复发作的病理基础［6］。而这种不可逆性气道狭窄主要是由气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)异常增殖引起的。

目前，西医治疗哮喘首推糖皮质激素和β2受体激动剂，其中糖皮质激素对气道重塑抑制作用明确，但长期或大量应用可能引起一系列的副作用［7］，故寻求中医药干预病毒诱发哮喘免疫机制及气道重塑的研究成为哮喘研究的重要课题。本课题选用了由哮喘经验方研制而成的咳喘宁口服液，通过观察咳喘宁对RSV诱发哮喘大鼠血清IL-4、IFN-γ的调节作用及对ASMCs增殖水平（OD值）的影响，明确咳喘宁治疗哮喘的免疫机制及其抑制RSV诱导ASMCs增殖的作用机制。

1　材料

1.1实验动物大鼠60只（洁净级、雄性、120～180 g、28～42 d，由湖南中医药大学实验动物中心供给）。所有动物均饲养于湖南中医药大学动物实验室。

1.2实验用药咳喘宁口服液：麻黄、黄芪、杏仁、桃仁、石膏、大青叶、细茶叶、甘草。由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供[（湘）卫药剂（06）05第085100号]，批号:201405，100 mL/瓶，含50g生药。对照药物：硫酸沙丁胺醇片（姑苏弘森药业有限公司，批号：022150404）；醋酸泼尼松片（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：20140515）。

1.3主要仪器和试剂

1.3.1主要试剂鸡卵清白蛋白（OVA）（上海丽珠东风技术有限公司）；呼吸道合胞病毒（武汉市武昌区华东试验试剂公司）；PBS缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）；4%多聚甲醛（北京鼎园公司）；大鼠白介素-4、扰素-γ酶联免疫检测试剂盒（上海天晶生物科技有限公司）；D-Hanks液（南京森贝伽生物科技有限公司）；Ⅰ型胶原型（上海谷研科技有限公司）；牛血清白蛋白（成都瑞芬思）；木瓜蛋白酶（源叶生物）；DMEM（Gibco CM995）；优级胎牛血清（天津市海洋生物有限责任公司）；胰蛋白酶/EDTA消化液（中国医学科学院生物工程研究所）；青霉素-链霉素双抗（ST488）；MTT液（ST316）；细胞鉴定试剂:大鼠抗α-actin单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒（二抗）（上海研域生物科技有限公司）。

1.3.2主要仪器医用超声雾化（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；雾化器（湖南中医药大学动物实验中心提供）；湖南中医药大学中西医结合学院细胞培养室提供：离心机、酶标仪、冰箱、自动纯水双蒸器、倒置显微镜，37℃、5%CO2培养箱，细胞培养板等。

2　方法

2.1哮喘模型制备与分组

采用我科已建立的方法［8］,并参照文献［9］造模。除正常组10只外，其余大鼠于第1天和第8天分3处注射（两下肢内侧皮下各注射0.25 mL，腹腔注射0.5 mL）由PBS稀释的1 mL无菌抗原液（含10 mg卵清白蛋白+100 mg氢氧化铝凝胶）致敏，正常组注射PBS致敏；第9天至第21天为激发阶段，将大鼠放入容积为10 L的雾化箱内（内有一雾化气孔和一通气孔），通过超声雾化器以1%卵清白蛋白生理盐水溶液20 mL雾化，每次20 min，隔天雾化1次，连续2周；观察大鼠精神、饮食、活动及呼吸，如发现大鼠精神变差、饮食减少、活动减少、呼吸频率加快的现象，提示激发成功,停止激发；第21、35、49天以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后再以滴度为1.0×106空斑形成单位的RSV 50μL经鼻腔滴入使大鼠感染RSV诱发哮喘，经RSV滴鼻的大鼠出现喷嚏、鼻腔有少量卡他样无色透明分泌物、弓肩耸背、点头样呼吸、腹肌抽搐、甚至站立不稳时即为哮喘急性发作，提示造模成功。正常组以生理盐水进行雾化及滴鼻。

2.2中药血清制备

选取9只大鼠随机分成3组，分别为：咳喘宁大、中、小剂量组。药物配制：咳喘宁口服液30 mL，大中小剂量组给药剂量相当于儿童（体质量）每日用量的1、5、10倍（按比例计算）。中剂量为大剂量1 mL加蒸馏水4 mL，小剂量为中剂量1 mL加蒸馏水4 mL。大鼠预先禁食12 h，灌胃给予相应药物及蒸馏水，2 h及3 h后各加强给药1次。10%水合氯醛麻醉，无菌条件下自心脏采血，离心血清（3 000 r/min，20 min，4℃），血清56℃下30 min灭活，分装于EP管中，-80℃保存备用。

2.3在体实验

2.3.1干预与标本提取造模大鼠分为5组，分别为：哮喘模型组，泼尼松与沙丁胺醇混悬液治疗组（简称西药治疗组），咳喘宁大、中、小剂量组。各干预组在造模完成当天（即第49天）开始灌胃给药，每日1次，连续7 d，直至处死。按照《中医科研设计与统计学》，体表面积-剂量换算法，将人临床用药剂量折算为大鼠用药剂量，各组药物用量如下：西药治疗组予混悬液醋酸泼尼松7.0 mg/（kg·d）、沙丁胺醇片剂1.1 mg/（kg·d），咳喘宁大剂量组5.0 g/（kg·d），咳喘宁中剂量组2.5 g/（kg·d），咳喘宁小剂量组1.25 g/（kg·d），正常组及模型组予蒸馏水灌胃，每日灌胃1次。各治疗组药物均以蒸馏水稀释，各组灌胃容量均为10 mL/（kg·d）。

2.3.2ELISA法检测IL-4、IFN-γ最后一次灌胃治疗后，称量各组大鼠体质量，以10%水合氯醛3.0 ml/kg腹腔内注射麻醉大鼠。然后打开腹腔，腹主动脉取血4 mL，标本由无菌干燥管收集，静置20 min后，4℃2 000 r/min离心，10 min，分离血清，-20℃以下保存。取材测定过程中，由于血清量过少、分离不纯、蛋白质凝集沉淀现象等原因导致部分标本不合格，故各组均只选取7个标本结果进行比较。取冰冻血清样本，室温下融解，采用ELISA法定量检测，严格按试剂盒操作，测量血清IL-4和IFN-γ值。

2.4体外实验

2.4.1ASMCss的分离、培养及鉴定哮喘模型组和正常组于造模成功后分别取支气管平滑肌进行细胞培养，参照文献［10-12］并改良方法，先用10%水合氯醛（4.0 mL/kg）腹腔注射处死大鼠，后以75%酒精消毒表皮，从腹部至颈部依次剪开皮肤、肌肉，腹主动脉放血后剪开胸腔，从颈部往下迅速分离出气管与肺部组织，剪去心脏，将气管及肺组织转移至含有DHanks液培养皿，D-Hanks液漂洗2次，用角膜剪仔细剔除支气管周围结缔组织、血管等，沿支气管纵轴剪开管腔，用手术刀刮除内外膜，直至气管接近透明，用眼科虹膜剪将气管段剪成1 mm或以下的组织块。将剪好组织块装入15 mL离心管中，加入配制好的I型胶原酶溶液2 mL（用D-Hanks液配制成含I型胶原酶消化液2 mg/mL、木瓜蛋白酶2.5 mg/mL、牛血清白蛋白2.5 mg/mL的溶液），玻璃滴管反复轻轻吹打混匀，37℃，5%CO2孵箱中消化30 min，取出后用含20%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，将离心管800 r/min离心5 min，静置2 min后，弃上清，再加0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA溶液2 mL，以同样方法消化15 min，离心去上清，加入含有20% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM液，吹打20次后，静置10 min，将上层液转移至25 mL培养瓶，继续吹打离心管下层组织块，静置，转移至培养瓶，重复几次，直至组织块尽可能分离，最后全部装入培养瓶。2 d换液1次。细胞铺满瓶底90%进行传代。实验用3代细胞，在倒置显微镜下，细胞通过形态学观察并经α-action免疫细胞化学染色阳性，鉴定培养的细胞为平滑肌细胞。

2.4.2MTT检测各组大鼠ASMCs的增殖水平取第3-7代培养的大鼠ASMCs，0.25%胰蛋白酶/ 0.02%EDTA溶液2 mL，消化10 min，用含10%FBS的DMEM培养24 h后，换无血清DMEM培养24 h，使细胞生长同步于G0期，换用含10%FBS的DMEM液，随机分为6组：空白对照组：培养的正常大鼠ASMCs，每孔/瓶中加入DMEM干预；哮喘模型组：培养的哮喘大鼠ASMCs，每孔/瓶中加入DMEM干预；西药治疗组：培养的哮喘大鼠ASMCs，每孔/瓶中加入等剂量沙丁胺醇+泼尼松溶液（终浓度为10 nmol/L）；咳喘宁大、中、小剂量血清组：培养的哮喘大鼠ASMCs，每孔/瓶中，分别加入大、中、小剂量咳喘宁血清，给药剂量分别为12.5 g/（kg·d）、6.25 g/（kg·d）、1.25 g/（kg·d）。每4个复孔/瓶为一组，培养24 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）50μL，放入37℃，5%CO2培养箱4 h后去除上清，实验重复3次，然后加入二甲基亚砜150μL，震荡10 min后，酶联免疫检测仪于450 nm处测定各孔吸光度（OD）值。

2.5统计学分析

3　结果

3.1酶联免疫检测各组大鼠血清IL-4、IFN-γ的表达变化

与正常组比较，哮喘模型组血清IL-4值明显升高、血清IFN-γ值明显降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；与哮喘模型组相比，西药治疗组、咳喘宁各剂量组血清IL-4明显降低、IFN-γ明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与西药治疗组比较，咳喘宁中、小剂量组血清IL-4、IFN-γ值无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；与大、小剂量组相比，中剂量组血清IL-4值降低较为明显、IFN-γ值相对升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　各组大鼠血清IL-4、IFN-γ结果（±s,n=7,pg/mL）

表1　各组大鼠血清IL-4、IFN-γ结果（±s,n=7,pg/mL）

注：与正常组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05；与大、小剂量组比较，◆P＜0.05。

组别正常组模型组西药治疗组咳喘宁小剂量组咳喘宁中剂量组咳喘宁大剂量组F值P值剂量--7mg(泼)+1.1mg（沙）/（kg·d）1.25 g/(kg·d) 2.5 g/(kg·d) 5.0 g/(kg·d) IL-4 17.97±0.54 34.28±3.45★★15.87±1.10＃14.57±2.16＃14.08±1.56＃◆19.67±1.31＃41.09＜0.01 IFN-γ 52.28±1.77 34.72±1.24★★47.76±4.37＃43.20±6.20＃48.24±3.46＃◆46.97±3.23＃14.62＜0.01

3.2细胞鉴定

在倒置显微镜（×100）下，经原代培养的ASMCs呈梭形，有较长的突起，圆形的细胞核位于细胞中央，呈疏密相间、典型“峰和谷”生长状态。a-actin免疫细胞化学染色，反应产物呈棕黄色。97%细胞a-actin染色阳性，所培养的细胞为平滑肌细胞（见图1）。

3.3各组ASMCs增殖水平（OD值）

与空白对照组比较，其余5组差异均有显著统计学意义（P＜0.01）；与哮喘模型组比较，其余五组差异有显著统计学意义（P＜0.01）；与沙泼干预组比较，咳喘宁大剂量血清组、中剂量组、小剂组组间差异无统计学意义（P＞0.05）；与咳喘宁大、小剂量血清中比较，中剂量血清组差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图1　大鼠ASMCs a-actin染色显微光镜图（×100）

表2　各组ASMCs增殖水平光密度值（OD值）（±s）

表2　各组ASMCs增殖水平光密度值（OD值）（±s）

注：与空白对照组比较，★★P＜0.01；与哮喘模型组比较，＃P＜0.05；与大、小剂量组比较，◆P＜0.05。

组别复孔OD值空白对照组4 0.74±0.05＃哮喘模型组4 1.00±0.04★★西药治疗组4 0.54±0.03★★＃咳喘宁小剂量血清组4 0.61±0.04★★＃咳喘宁中剂量血清组4 0.51±0.03★★＃◆咳喘宁大剂量血清组4 0.58±0.03★★＃F值93.9 P值＜0.01

4　讨论

支气管哮喘属中医学“哮证”“齁喘”等领域。《丹溪心法》首先命名为“哮喘”，提出“哮喘专主于痰”。历代治喘名家都很重视伏痰在哮喘中的作用，将哮喘的发病机制概括为“外因诱发，触动伏痰，痰随气升，气因痰阻，相互搏结于气道”。自古以来，中医药防治哮喘有着丰富的经验，具有疗效显著、方式多样、副作用小等优势。

本实验以哮喘实验动物模型为载体，从动物整体水平研究中药治疗哮喘的作用机制。选用的咳喘宁口服液是由湖南中医药大学第一附属医院儿科主任根据病毒诱发儿童哮喘的机理，以清热化痰平喘的传统古方五虎汤为基本方研制而成。方中君药为麻黄和苦杏仁，功在调畅肺气、止咳平喘、祛除伏痰；黄芪、石膏、大青叶，三者共为臣药，合用以清除哮喘激发因素、提高机体免疫力；桃仁、细茶叶、甘草三药共为佐使，共奏宣肺化痰、止咳平喘、扶正祛邪、清热解毒之良效。从现代医学角度出发，亦能清除哮喘激发因素、降低气道反应、抑制气道重塑等，从而防治哮喘［13］。

本实验证实，咳喘宁口服液，尤其是中剂量组对治疗RSV诱发的哮喘大鼠疗效较为显著，通过上调IFN-r水平、降低IL-4水平表达从而降低气道炎症反应，维持Th1/Th2平衡来调节机体免疫。咳喘宁治疗支气管哮喘可能与其能够抑制气道平滑肌增殖、影响哮喘气道重塑关系密切，同时也为“伏痰、瘀”理论在病毒诱发哮喘中的作用机制提供了实验依据。

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（本文编辑 杨瑛）

Effect of Kechuanning on Serum IL-4 and IFN-γin RSV Induced Asthma Rats and Its Role in ASMC Proliferation

TAN Wei1,LI Ying2*,LUO Yinhe2,WANG Mengqing2,SHU Lan2,TANG Liqiong1,GONG Ximei1, LI Ping1,TAO Hong2,PENG Xinxin2
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To observe the regulating effect of Kechuan Ning on serum IL-4,IFN and the proliferation of airway smooth muscle cells(ASMCs)level(OD level)in RSV induced asthma rats.And to provide experimental basis for the prevention and treatment of asthma. Methods The 60 rats were randomly divided into 6 groups.Except the normal group,the other rats were induced asthma by sensitization and virus to making models.On the day of succesful modeling,the IL-4 and IFN-γ were determined by ELISA.The smooth muscle cells were cultured and the smooth muscle cells were identified as smooth muscle cells by inverted microscope.The containing serum groups were prepared and added ASMCs at 3-7 passages.The proliferation of ASMCs(OD value was determined by MTT method.Results The ELISA result shows that the serum levels of IL-4 and IFN-γ levels in the Western medicine group and Kechuanning group were with statistical significance comparing with the model group(P＜0.05).Compared with high dose and low dose groups,the serum levels of IL-4 and IFN-γ levels had statistic significance(P＜0.05).MTT assay shows that the rest of five groups had statistical significance comparingthe blank control group(P＜0.01).Compared with the large-dose and small-dose serum groups,the difference in medium-dose serum group was significant statistically(P＜0.05).Conclusion Kechuanning shows obviuos effect on treatment of RSV induced asthma rats.The airway inflammation is reduced by upregulating IFN-γ level and reducing IL-4 level expression,the body immune system is regulated by maintaining the balance of Th1/Th2.Kechuanning in treatment of bronchial asthma may be closely related to the inhibition of airway smooth muscle proliferation and influence of airway remodeling.

Kechuanning;asthma;interleukin-4;interferon-γ;airway smooth muscle cells

R285.5；R256.12

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.11.002

2016-07-06

国家自然科学基金（81674025）；湖南省自然科学基金（14JJ3120）。

谭维,女，在读硕士研究生，研究方向：中医小儿肺系疾病。

*李英，女，讲师，博士，E-mail：120812828@qq.com。