白术挥发油抑菌及抗肿瘤作用研究*

张雪青， 邵邻相， 吴文才， 邵文丽， 赵铁军， 徐玲玲

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)



白术挥发油抑菌及抗肿瘤作用研究*

张雪青， 邵邻相， 吴文才， 邵文丽， 赵铁军， 徐玲玲

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

选用浙江磐安产白术，用水蒸气蒸馏法提取白术挥发油，气相色谱-质谱法检测出27种化学组分，其中主要是烯类化合物，含量最大的为莪术烯.比浊法检测发现，白术挥发油对多种细菌具有较好的抑菌活性；噻唑蓝(MTT)法检测表明，白术挥发油对肺癌A549和宫颈癌Hela细胞生长皆有极明显的抑制作用，且呈现剂量依赖效应;单细胞凝胶电泳结果表明，白术挥发油对肿瘤细胞DNA具有损伤作用.

白术；挥发油；抑菌活性；抗肿瘤作用

中药白术为菊科多年生草本植物白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz)的干燥根茎，其性温、味甘苦，具有健胃、益脾、补气、利尿、和中等功效.白术为我国传统中草药，被列为“浙八味”中药之一，主产于浙江、安徽、湖北和湖南等地，以浙江磐安、新昌地区产量最大[1-2].白术作为大宗常用药材，药用价值较高，国内外需求量均较大.2013年我国白术出口量约为1.65万t，较上年同比增加约50%；出口额达到6 417.16万美元，同比上涨近174%[3].临床上，白术具有较广泛的用途和疗效，为治疗和改善肿瘤的常用中药，可用于食管癌、胃癌、肝癌等消化系统肿瘤及肺癌的治疗.此外，研究还表明，白术具有强壮、提高机体免疫力、改善胃肠功能和抑菌等作用[4-10].研究表明，白术主要成分为挥发油、内酯及多糖化合物[11-13].近年来，对白术挥发油的生物活性研究逐渐成为研究的热点.

目前，已有不少的实验表明白术挥发油对动物肿瘤生长具有抑制作用.王翕等[14]、沈国庆等[15]及邱根全等[16]的研究表明，白术挥发油对小鼠移植性肿瘤肝癌H22及肉瘤S180有显著的抑制作用.孙烨等[17]发现，白术挥发油对小鼠肺腺癌有明显的抗癌性恶病质作用.张宗等[18]发现，白术挥发油对小鼠艾氏腹水癌也有一定的抑制作用.文献[19]的研究表明，含白术成分的四君子汤能够抑制小鼠移植性胃癌的生长.然而，这些实验主要集中于研究白术挥发油对动物实体瘤增长的抑制作用，有关体外相关实验，特别是人源肿瘤的研究相对较少.另外，对白术基础药理分子作用机制方面的研究比较粗糙，仍需更深入的比较研究，这使白术作用于离体肿瘤细胞的研究工作显得尤为重要，成为白术研究领域的焦点方向之一.本实验旨在分析白术挥发油的主要成分，研究其对体外菌株和人肺癌和宫颈癌细胞增殖的影响，为传统中药白术的进一步开发利用提供一定的实验依据.

1 材料与方法

1.1 细菌、药物和细胞

供试菌：鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、摩氏摩根菌、溶血性链球菌均来自浙江金华市中心医院.

白术：浙江磐安地区产白术根茎.

细胞：人肺癌细胞株A549、人宫颈癌细胞株Hela，购自中国科学院上海细胞生物研究所.

1.2 主要试剂与仪器

DMEM培养基、胰蛋白酶为美国Gibco.BRL公司产品；新生牛血清购自杭州四季青生物公司；吐温-80、二甲基四氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖、溴化乙锭(EB)，均为Sigma公司产品.

QP5050A型气相色谱-质谱仪：日本岛津公司；3111型CO2培养箱、1500型全自动酶联免疫检测仪：美国热电公司；荧光显微镜eclipse e600：日本尼康公司.

1.3 细胞培养和药物处理

人肺癌细胞株A549和人宫颈癌细胞株Hela培养于含10%新生牛血清DMEM培养基和双抗(青霉素和链霉素，100 IU/mL)的完全培养基中，37 ℃，5%CO2,饱和湿度环境条件下连续培养.

1.4 白术挥发油提取

选用浙江磐安地区产白术根茎，水蒸气蒸馏法提取白术挥发油，无水硫酸钠干燥，过滤灭菌后配制成5%白术挥发油乳剂，含3%吐温-80，4 ℃保存备用.

1.5 白术挥发油成分分析

以气相色谱-质谱法(GC/MS)分析白术挥发油成分.

色谱柱：VF-Wax石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μmol/L)；初始温度为60 ℃(保持2 min)，升至250 ℃(保持10 min)，升温速度为15 ℃/min；汽化温度为230 ℃；载气为He，流量为1.0 mL/min；分流比为200∶1；进样量为1.0 μL.

质谱检测器：EI电离源,源温为200 ℃，电离电压为70 eV.质谱标准库为美国国家科学技术研究所出版的NIST库.

1.6 挥发油抑菌活性测定

挥发油的抑菌活性测定采用比浊法.菌液浓度为2×104/mL，以100 μL/孔接种于96孔板上，然后加入挥发油100 μL，使其最终质量浓度分别为1.25，2.50和5.00 mg/mL.以只加同体积培养基的为调零孔，并设置溶剂吐温-80组.每组设4个复孔.置于细胞培养箱中孵育24 h后，利用全自动酶标仪在600 nm波长测定吸光度，按下式计算抑菌率：

1.7 细胞活力检测

采用MTT法检测细胞活力.取对数生长期的细胞，按90 μL/孔接种于96孔板上，培养12 h后加入10 μL白术挥发油，使其最终质量浓度分别为5，10，20，50，100，200，500和1 000 μg/mL.分别继续培养24 h后，加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,待反应4 h后弃去上清液，加入二甲基亚砜150 μL/孔，排枪混匀至沉淀完全溶解，避光15 min后酶标仪在570 nm波长测定吸光度.同时设置培养基空白对照组和溶剂吐温-80阴性对照组.每组设置4个复孔.如下计算抑制率:

1.8 DNA损伤检测

以碱性单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis,SCGE)检测DNA损伤程度.将载玻片浸泡0.2%琼脂糖溶液后取出，37 ℃过夜干燥.在镀过膜的载玻片上搭建盖玻片，使之形成22 mm×10 mm×0.17 mm的狭缝.取待测细胞悬液与等量1%低熔点琼脂糖溶液混匀，将细胞悬液灌入窄缝中，在琼脂糖凝固后小心移去盖玻片.用裂解缓冲液(2.5 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，200 mmol/L NaOH，1%肌苷酸钠，临用前加入1%Triton和10%二甲基亚砜，pH 10)裂解细胞60 min,蒸馏水漂洗后置于电泳液(1 mmol/L EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 13)中解旋20 min，随后在0.86 V/cm强度下电泳20 min.电泳后，用中和液(0.4 mol/L Tris-HCl，pH 7.4)清洗3次.从裂解至中和,温度控制在4 ℃.依次用70%和100%乙醇液各脱水5 min，溴化乙锭溶液(20 μg/mL)染色15 min.用荧光显微镜eclipse e600拍照成像；用CASP软件进行数据分析.

1.9 统计方法

采用SPSS19.0统计软件进行显著性检验，OriginProPorable8.5软件作图.

2 结果与分析

图1 白术挥发油化学成分总离子流图

2.1 白术挥发油的成分分析

气相色谱-质谱法分析得到白术挥发油的总离子流图如图1所示,共检测出27种成分，主要为烯类化合物，占总峰面积的73%.表1显示:莪术烯为白术挥发油的主要成分，含量达65.74%；5-异丙基-3,8-二甲基-1，2，4，5，6，7-六氢薁占总峰的10.46%；1,2,3,3a，4,5,6,7-八氢-1,4-二甲基-7-(1-甲乙基)-[1R-(1α,3aβ,4α,7β)]-甘菊环占7.11%；其余含量大于1%的有β-瑟林烯、(4aR,5S)-4a,5-二甲基-3-丙烷-2-亚基-5,6,7,8-四氢化-4H-2-萘亚甲基、4,4-二甲基-3-(3-甲基-3-亚丁烯基)-2-亚甲基二环[4.1.0]庚烷、石竹烯和1,3-异丙基三环[4,3.1.1(2,5)]十一碳-10-酮.

表1 白术挥发油的化学成分及其相对含量

表2 白术挥发油作用24 h对细菌生长的抑制作用

2.2 白术挥发油的抑菌效果

为了证实白术挥发油的抑菌活性，本实验采用比浊法检测挥发油对细菌生长的影响.表2显示,一定浓度的白术挥发油作用于细菌24 h后，各供试菌的生长均受到了显著抑制.其中：白术挥发油对鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和草绿色链球菌的抑制作用较明显，抑菌率达95%以上；而对大肠杆菌、表皮葡萄球菌、摩氏摩根菌和溶血性链球菌的抑制作用相对较弱，在挥发油含量为5 mg/mL作用24 h后的抑菌率分别为29.74%，24.84%，27.10%和26.28%；1.25 mg/mL挥发油作用于肺炎克雷伯菌24 h后的抑制率为47.54%.

2.3 白术挥发油对癌细胞增殖的影响

为了检测白术挥发油的抗肿瘤活性，本实验利用MTT法检测肿瘤细胞的生长，结果显示：白术挥发油可以明显地抑制人肺癌A549细胞和人宫颈癌Hela细胞的活性；而且，随着挥发油剂量的增加，对肿瘤细胞生长的抑制作用增强，呈剂量依赖性.如图2(a)所示，白术挥发油在10，20，50，100，200，500和1 000 μg/mL时作用于A549细胞24 h后，细胞生长抑制率分别为0.42%，4.07%，32.99%，49.16%，67.85%，80.38%和95.93%，随着挥发油剂量的增加,肿瘤细胞生长抑制率增大.如图2(b)所示，白术挥发油作用于Hela细胞时呈现同样的抑制效果，在挥发油剂量为10，20，50，100，200和500 μg/mL时，Hela细胞生长的抑制率分别为6.95%，24.97%，30.06%，76.73%，88.2%和97.49%.以上结果表明，白术挥发油能够明显地抑制人肺癌A549和宫颈癌Hela细胞的增殖，并表现出一定的剂量依赖性.

(a)对人肺癌A549细胞 (b)对人宫颈癌Hela细胞图2 MTT法检测白术挥发油对肿瘤细胞增殖的抑制作用

图3 彗星电泳法检测白术挥发油对肿瘤细胞DNA的损伤

2.4 白术挥发油对肿瘤细胞DNA的损伤

为了进一步探究白术挥发油抑制肿瘤细胞生长的细胞生物学机制，本实验采用单细胞凝胶电泳法检测了肿瘤细胞DNA的受损情况.如图3所示：50 μg/mL白术挥发油作用于A549细胞24 h后，与对照组相比，白术挥发油处理组细胞尾部DNA碎片明显增多，“彗尾”也明显增长(P<0.01)；20 μg/mL白术挥发油作用于Hela细胞24 h后，细胞尾部DNA碎片和“彗尾”也较对照组有极明显的增加(P<0.01).这些结果均表明，白术挥发油以50,20 μg/mL分别作用于细胞24 h后，A549和Hela肿瘤细胞内DNA明显受损伤，可能引起细胞凋亡的发生.

3 讨 论

文献报道白术挥发油主要成分为苍术醇、苍术酮和萜烯类化合物，这与本实验的气相色谱-质谱分析结果基本一致.然而，关于白术挥发油的具体成分及含量，不同的文献报道有所差异，这些差异主要与白术的产地、挥发油的提取工艺及成分分析方法有关.本实验对白术挥发油成分的分析表明，在所有组分中，莪术烯的含量最高，占65.74%.这与彭万仁等[20]报道的河南白术挥发油中含量最高的成分一致，但其含量相对较低.这可能与本实验选用品质较优的浙江白术有关.

目前，有关植物挥发油抑菌作用的研究报道比较多，但有关白术挥发油抑菌作用的研究鲜有报道.本实验研究表明，白术挥发油具有抑制多种菌株生长的作用，且抑制效果具有菌种差异性.这为白术挥发油抑菌效果的研究提供了一定的实验依据.

本文重点分析了白术挥发油对人肿瘤细胞体外增殖的影响.结果表明，白术挥发油可明显抑制人宫颈癌HeLa和肺癌A549细胞的增殖，从离体实验的角度证实了白术的抗肿瘤作用，为后续研究白术抑制肿瘤细胞生长的机制提供了一定的参考.随着白术抗肿瘤作用的进一步揭示，研究者对白术抗肿瘤的相关机制进行了一些初步的探讨，主要有以下几个方面：1)引起细胞凋亡或坏死.文献[21-22]的研究表明，白术通过调控凋亡抑制基因bcl-2、突变型P53基因的表达而诱导小鼠S180肉瘤细胞的凋亡；文献[23]发现,白术内酯能够抑制细胞自我更新并通过阻止Notch信号通路影响胃癌细胞生长.2)阻遏细胞周期.郑芳等[24]发现,白术阻遏大鼠小肠隐窝细胞IEC-6于G1/M期；文献[25]研究表明,白术内酯能够诱导小鼠B16黑色瘤细胞G1期阻滞.3)抗肿瘤侵袭转移.王郁金等[26]研究表明,白术挥发油可能通过抑制MMP-9的分泌起到抗小鼠H22肝癌淋巴道转移的作用.4)炎症反应和免疫调节.文献[16-17,27]发现，白术挥发油通过调节血清细胞因子TNF-α，IL-6和IL-2的异常表达抑制癌性恶病质，并可提高免疫球蛋白G，M和A的水平；文献[10]研究表明，白术可以有效提高小猪血清中IgG和IL-1的表达水平，从而提高机体免疫力.然而，这些研究主要集中于动物在体实验，具体机制研究比较浅显，还需要更深入地进行分子机制的探索.对于白术抗肿瘤成分的研究，目前多数文献报道已证实白术挥发油为抗肿瘤的主要成分，但其中具体成分仍不是很清楚.沈国庆等[15]的实验结果表明，白术挥发油的抗肿瘤成分可能存在于白术挥发油中极性小的部分，这为分析分离白术挥发油中抗肿瘤活性成分给出了一定的提示.然而，也有少数文献对白术中的多糖及一些氨基酸成分进行了研究报道.文献[28]研究表明，白术多糖可通过提高CD4+和CD8+T细胞的表达水平，改善免疫力;张小平等[29]发现,白术多糖对人白血病细胞K562有明显的抑制作用，这将引起研究者对白术的另一类有效成分——多糖生物活性的关注.此外，以后的研究可以考虑一些复方制剂，如白术和其他抗癌药物的联用.

白术作为我国传统的中草药，已有报道显示白术挥发油有多种生物活性，但由于其成分复杂、化学稳定性差，对于白术挥发油的生物活性所对应的具体成分的研究有一定的困难.此外，白术产地、提取工艺的不同导致成分分析结果存有一定的差异，因此，还需要统一可靠的药材鉴定分析手段.这些问题的解决将对白术抗肿瘤作用的具体分子机制的分析有着重大的意义，为白术的进一步开发利用提供可靠依据.

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(责任编辑 薛 荣)

On the anti-bacterial and anti-tumor functions ofAtractylodesmacrocephalaKoidz volatile oil

ZHANG Xueqing， SHAO Lingxiang， WU Wencai， SHAO Wenli， ZHAO Tiejun， XU Lingling

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

AtractylodesmacrocephalaKoidz, a traditional Chinese medicine, was dried roots of compositae.Atractylodesmacrocephalafrom Pan′an, Zhejiang Provice was used in this study. The essential oil from atractylodes was extracted by steam distillation, the chemical constituents were analyzed by GC/MS. Twenty-seven compositions were identified and most of the compounds were Alkenes. The anti-bacterial effect of essential oil was observed in a nephelometry assay. In addition, the essential oil could suppress the growth of two human cancer cell lines, A549 cells and Hela cells, in a dose dependent manner. After treating the tumor cells withAtractylodesmacrocephalaKoidz volatile oil, DNA damage was detected by single cell gel electrophoresis assay.

Atractylodesmacrocephala; volatile oil; antibacterial; antitumor

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.04.013

2015-09-02；

2015-12-25

国家自然科学基金面上项目(31470262)；浙江省科技厅公益技术应用研究计划项目(2015C33149)；浙江省重中之重学科“生物学”2014年度开放基金资助项目(KFJJ2014003)；浙江省大学生科技创新暨新苗人才计划项目(2015R404011)

张雪青(1990-)，女，陕西富平人，硕士研究生.研究方向：分子细胞生物学.

徐玲玲.E-mail: xll0518@zjnu.cn

Q949.95

A

1001-5051(2016)04-0436-07