石斛合剂对胰岛素抵抗肝细胞模型的影响
2016-12-06林心君郑远燕张捷平刘言凤施红
林心君,郑远燕,张捷平,刘言凤,施红
(1.福建中医药大学中西医结合学院,福建福州350122;2.泉州市丰泽区东海街道社区医院,福建泉州362400)
石斛合剂对胰岛素抵抗肝细胞模型的影响
林心君1,郑远燕2,张捷平1,刘言凤1,施红1
(1.福建中医药大学中西医结合学院,福建福州350122;2.泉州市丰泽区东海街道社区医院,福建泉州362400)
目的初步探讨石斛合剂对胰岛素抵抗(IR)肝细胞模型的影响,旨在阐明石斛合剂改善IR的作用及机制。方法采用实验筛选的胰岛素造模浓度培养LO2细胞24 h,建立IR肝细胞模型。以空白血清和石斛合剂含药血清(浓度由实验筛选出)干预正常肝细胞和IR肝细胞,葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GLU-GOD)法检测培养液中残存葡萄糖水平,计算胰岛素敏感指数;并检测加PI3K抑制剂后石斛合剂对IR肝细胞胰岛素敏感指数的影响。结果由实验筛选出的造模胰岛素浓度为5×10-5mol/L,石斛合剂含药血清和空白血清浓度为2.5%;含药血清模型组胰岛素敏感指数虽低于正常肝细胞组(P<0.05),但与IR肝细胞组比较则显著提高(P<0.05);与IR肝细胞组比较,加抑制剂后各组细胞的胰岛素敏感指数均明显下降(P<0.05)。结论中药复方石斛合剂可改善IR肝细胞的胰岛素敏感指数,减轻胰岛素抵抗,可能部分通过PI3K信号途径起效。
胰岛素抵抗肝细胞;胰岛素敏感指数;石斛合剂
胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是指胰岛素作用的靶器官(如肝脏、骨骼肌、脂肪组织)对胰岛素作用的敏感性下降的一种病理现象,是糖尿病、肥胖等代谢性疾病的共同土壤[1-2],因此改善IR的研究具有重要的临床意义。研究表明:中医药通过多途径、多环节、多靶点发挥作用,许多单味中药及复方制剂都具有降低胰高血糖素、增加葡萄糖摄取和利用、刺激胰岛素分泌、调节血脂等作用[3-6]。本课题组从1995至今的石斛合剂系列研究证明:具有滋阴益气活血功效的石斛合剂(现为福建省二人民医院院内制剂,专利申请号:201110408411.0),不仅可明显改善患者临床症状,降低糖化血红蛋白,综合疗效优于二甲双胍、参麦散、玉液汤等,而且还能增加胰岛素受体的表达,促进HepG2细胞的糖代谢[7-10]。本实验旨在通过建立IR肝细胞模型,在细胞水平上观察该方对高胰岛素诱发IR的影响,以初步探讨其改善IR的作用及机制。
1材料
1.1 实验仪器倒置相差显微镜[IX70,日本OLYMPUS公司];酶标仪(ELx800,美国Bio-TEK公司);细胞培养箱(HF212UV,美国Thermo Forma公司)。
1.2 药品与试剂中药复方石斛合剂(石斛、黄芪、知母、丹参、五味子、葛根等)购自福建中医药大学国医堂;RPMI1640培养液、胎牛血清、溴化-(4,5-二甲-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)购自Genview公司;PI3K抑制剂购自碧云天生物技术研究所;未提及试剂均购自美国Sigma公司。
1.3 细胞及动物来源人肝细胞株(LO2)购于上海细胞所;SPF级Wistar大鼠,雄性,体质量190~230 g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,合格证号:2007000546931。
2方法
2.1 LO2细胞的培养LO2细胞用含10%胎牛血清的培养基,在37℃、5%CO2环境培养、传代。
2.2 石斛合剂含药血清的制备参照课题组前期研究[10]。
2.3 筛选含药血清浓度
2.3.1 LO2细胞存活率取对数生长期的LO2细胞,3×103/m L接种于96孔板,待细胞长至80%,先以不同浓度的含药血清和空白血清(见表1)孵育12 h、24 h、48 h,再加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL,避光培养4 h,弃上清,酶标仪测定吸光度(OD),筛选最佳含药血清浓度。
2.3.2 细胞形态学观察同样方法培养LO2细胞,加入由上述实验中筛选出的的含药血清和空白血清浓度,24 h后去上清,PBS洗2遍,10%甲醛固定,Giemsa染色法观察镜下细胞形态。
2.4 筛选造模胰岛素浓度取对数生长期LO2细胞,按106/瓶接种于培养瓶,待细胞贴壁后去旧培养基,分别加入不含胰岛素的全培液(对照组)和不同浓度(5×10-4mol/L、5×10-5mol/L、5×10-6mol/L)的胰岛素全培液24 h后,消化,重悬,每组按3× 105/管分装,离心,去上清,加入含3.5×10-5mol/L胰岛素的无酚红培养液,37℃温育3 h后取上清,GOD-POD法测定各组(对照组、5×10-6mol/L胰岛
素组、5×10-5mol/L胰岛素组、5×10-4mol/L胰岛素组)的残存葡萄糖浓度。
2.5 筛选胰岛素的刺激浓度同样方法培养LO2细胞,按3×105/管分装15管,离心,去上清,分别加入含7×10-5mol/L、3.5×10-5mol/L、1.75×10-5mol/L、0.875×10-5mol/L、0 mol/L(对照组)胰岛素的无酚红培养液,孵育后,取上清,GOD-POD法测定残存葡萄糖浓度。
2.6 石斛合剂对IR肝细胞胰岛素敏感性指数的影响将肝细胞分6组:正常对照组(正常肝细胞)为A1组,模型对照组(IR肝细胞)为B1组,正常肝细胞+空白血清组为C1组,IR肝细胞+空白血清组为D1组,正常肝细胞+含药血清组为E1组,IR肝细胞+含药血清组为F1组。正常肝细胞相关组(B1、D1、F1组)予含5×10-5mol/L胰岛素的全培液,IR肝细胞相关组(A1、C1、E1组)予全培液,孵育24 h后,取上清,C1、D1组加空白血清,E1、F1组加含药血清,24 h后测定残存葡萄糖浓度,并计算胰岛素敏感性指数[11]。
2.7 加PI3K抑制剂(30 nmol/L)后石斛合剂对IR肝细胞模型岛素敏感指数的影响将肝细胞分6组:正常对照组(正常肝细胞)为A2组,模型对照组(IR肝细胞)为B2组,正常肝细胞+PI3K抑制剂组为C2组,IR肝细胞+PI3K抑制剂组为D2组,正常肝细胞+含药血清+PI3K抑制剂组为E2组,IR肝细胞+含药血清+PI3K抑制剂组为F2组,按上述方法造模、加药、测定培养液中残存葡萄糖浓度并计算胰岛素敏感指数。
2.8 统计学处理采用SPSS17.0软件处理数据。计量资料采用t检验,多个样本均数的比较采用方差分析。
3结果
3.1 不同浓度含药血清和空白血清对LO2细胞存活率的影响见表1。
表1 不同浓度含药血清和空白血清对LO 2细胞存活率的影响(x±s)
3.2 2.5%空白血清组及含药血清组细胞形态学观察见图1。由图1看出2.5%空白血清组及含药血清组的细胞胞核、胞质、胞膜结构完整、清晰,与正常组比较,细胞形态无明显差异,说明2.5%含药血清及空白血清无明显细胞毒性。
3.3 造模用胰岛素浓度筛选见图2。
3.4 刺激量胰岛素浓度筛选见图3。
3.5 石斛合剂含药血清对各组细胞胰岛素敏感指数影响见表2。
表2 石斛合剂含药血清对各组细胞胰岛素敏感指数影响(x±s)
3.6 PI3K抑制剂对各组细胞胰岛素敏感指数影响见表3。
表3 PI3K抑制剂对各组细胞胰岛素敏感指数影响(x±s)
4讨论
4.1 肝细胞胰岛素抵抗模型IR是代谢综合征的核心表现,关于IR研究日益被人们所重视,而探索稳定而有效的IR细胞模型成为IR相关疾病研究的关键问题,也是在细胞水平上深入研究IR发生机制的基础。目前比较常用的IR细胞模型有:高葡萄糖诱导培养模型、高胰岛素诱导培养模型、高类固醇诱导培养模型等,其中以较稳定的高胰岛素诱导培养模型的使用最为广泛[12-13]。肝脏是胰岛素发挥效应的重要靶器官,也是胰岛素受体分布最密集脏器之一,故本实验采用LO2肝细胞株加高胰岛素诱导培养法建立IR模型。
本实验筛选出2.5%(无毒浓度)为含药血清及空白血清浓度,最小有效浓度5×10-5mol/L为造模用胰岛素浓度,与文献[14]报道的浓度有别,考虑可能与实验条件的差异以及选用的肝细胞株不同有关。3.5×10-5mol/L及7×10-5mol/L这两种浓度的胰岛素都能增加胰岛素抵抗肝细胞的葡萄糖摄取,选用最小有效刺激浓度3.5×10-5mol/L。实验中选用最小有效的造模浓度和胰岛素刺激浓度,旨在尽可能减少高胰岛素对细胞的毒性。
4.2 石斛合剂对IR肝细胞模型胰岛素敏感指数的影响糖尿病属于祖国医学“消渴病”的范畴,是IR的代表性疾病,故医家多从“消渴病”的角度认识IR[15],认为其病位主要在肝、脾、肾三脏,以气、阴、阳虚为本,痰浊、瘀血、热毒为标。石斛合剂具有滋阴清热、益气活血的功效。本实验用石斛合剂含药血清干预IR肝细胞模型,结果显示:石斛合剂含药血清能提高胰岛素敏感性指数,改善IR;加入PI3K抑制剂后石斛合剂改善IR的作用消失,说明PI3K抑制剂能减弱甚至阻断石斛合剂改善IR的作用,提示石斛合剂可能通过PI3K通路改善IR。此作用是直接作用PI3K通路,还是继发效应还有待进一步深入研究。
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R285.5
A
1000-338X(2016)04-0040-03
2016-05-10
福建省卫生厅科技创新项目(2014-CX-29);福建省教育厅重点项目(JA15228)
林心君(1979—),女,讲师,博士研究生,研究方向:中西医结合治疗糖尿病研究。
施红,女,教授,博士生导师。E-mail:shihong3327@sina.com