日本仙人掌中仙人掌孢囊线虫形态和分子鉴定

龙 海, 李芳荣, 程颖慧， 谢泳桂， 李一农*

1深圳出入境检验检疫局,广东 深圳 518001；2深圳市检验检疫科学研究院， 深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，广东 深圳 518045



日本仙人掌中仙人掌孢囊线虫形态和分子鉴定

龙 海1,2, 李芳荣1, 程颖慧1， 谢泳桂1， 李一农1*

1深圳出入境检验检疫局,广东 深圳 518001；2深圳市检验检疫科学研究院， 深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，广东 深圳 518045

【背景】近年来,种苗等植物通过邮寄包裹进入我国的数量越来越多，有害生物随之入侵的风险与日俱增。深圳口岸曾多次从入境包裹中截获孢囊线虫、根结线虫等。【方法】2015年10月12日，深圳口岸在对日本邮寄来的仙人掌进行检疫时，从其根部发现了一种孢囊线虫。对该线虫进行分离，结合形态学和28S rDNA序列扩增并测序的方法，对截获的线虫进行鉴定。【结果】分离到了一种孢囊线虫,其形态特征与仙人掌孢囊线虫基本吻合，28S rDNA序列与GenBank 数据库中登录号为DQ328702的德国群体的同源性高达99%。因此，判定截获的线虫为仙人掌孢囊线虫。【结论与意义】入境包裹检疫需要引起口岸检疫部门的高度重视。采用形态学和分子生物学相结合的方法对植物寄生线虫进行鉴定，可以得到更加准确的结果。

仙人掌孢囊线虫； 邮检； 形态学； 分子鉴定

仙人掌孢囊属线虫Cactodera隶属线虫门Nematoda侧尾腺纲Secernentea垫刃目Tylenchida异皮科Heteroderidae异皮亚科Heteroderinae，是植物根系的一类固定性内寄生线虫(谢辉,2000)，目前已报道14个种(罗诺德·佩里和莫里斯·莫恩斯,2011)，可通过种苗进行远距离传播。仙人掌孢囊线虫最早在荷兰的仙人掌中被发现，并被描述为甜菜孢囊线虫Heteroderaschachtii，1941年Filipjev和Schuurmans Stekhoven把该种线虫命名为Heteroderacacti,1978年又更名为Cactoderacacti(Esser,1992)。该线虫在五大洲都有分布，我国曾在厦门(潘沧桑等,1997)和辽宁(Duanetal.,2012)发现该线虫。

2015年10月12日，深圳口岸在对日本邮寄来的仙人掌进行检疫时，从其根部发现了一种孢囊线虫，本试验对其形态学和分子生物学特征进行鉴定，以期为该线虫的检疫与防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与线虫分离

取仙人掌的根和根际土壤约500 g，放入封口袋中，做好标签，送至实验室。取约250 g样品，用双层纱布包好，置于漏斗中，加入清水至刚好没过样品，25 ℃放置12～24 h(毛小芳等，2004)。用凹面皿接取线虫悬浮液10 mL,在体式显微镜下检查，发现2龄幼虫后，用直接过筛法分离其孢囊(Subbotinetal.,2010)。

1.2 形态学鉴定

挑取线虫制成临时玻片，在光学显微镜(Zeiss Zmager MI)下观察，用Zeiss AxioCam HRC数码相机对线虫进行拍照，并用AxioVision 4.8.2自带的测量软件和de Man公式法(de Man,1884)对雌虫进行测计。

1.3 分子生物学检测

提取单条2龄幼虫的DNA，方法参见Longetal.(2006)，28S rDNA 基因PCR扩增参见顾建锋等(2013)。PCR扩增产物送深圳华大基因有限公司测序，用BioEdit 7.0 (Hall,1999)对序列进行编辑，在GenBank 数据库 (www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行BLAST分析，用MEGA 4.0(Tamuraetal.,2007)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态描述

2龄幼虫：虫体蠕虫状，唇区轻微缢缩；口针基部球圆形，头架明显(图1A)；侧区有4条刻线，食道腺充满体腔(图1B)；尾呈细长圆锥形，末端钝圆，具明显的透明区(图1C)。

雌虫：虫体呈柠檬形到近球形，珍珠白色、黄色或金色；颈部缢缩，阴门锥凸出。

孢囊：通常为柠檬形，有时圆形，颈和阴门凸出，浅褐色或中等褐色(图1D)。阴门凸位于膜孔下面紧接膜孔的位置，有时不明显；阴门锥无囊泡和下桥，有阴门小齿和环膜孔。

卵：椭圆形,长度约为宽度的2倍，卵壳刻点明显(图1D)。

雄虫：未见。

图1 孢囊线虫形态

2.2 形态测量值

2龄幼虫形态测量值如表1所示。

依据行业标准《仙人掌孢囊属线虫检疫鉴定方法》(国家质量监督检验检疫总局，2015)，本试验分离到的孢囊线虫日本群体形态特征及2龄幼虫测量值与文献记述的仙人掌孢囊线虫基本一致。

2.3 分子生物学特征分析

用引物D2A/D3Br对单条2龄幼虫进行PCR扩增，结果见图2，扩增产物长750 bp左右(GenBank登录号分别为KX230467-KX230473)。BLAST分析结果表明，孢囊线虫日本群体的28S rDNA基因序列与GenBank登录号为DQ328702的德国群体的同源性高达99%。基于28S rDNA基因序列的系统发育树(图3)表明，孢囊线虫日本群体和德国群体位于一个进化枝上，亲缘关系最近。

综合形态学比较和分子生物学分析得出，从日本邮寄的仙人掌中截获的孢囊线虫为仙人掌孢囊线虫Cactoderacacti。

图2 2龄幼虫PCR扩增产物

图3 28S rDNA序列构建的系统发育树

3 讨论

通过形态描述和测量值比较，初步判断从日本邮寄的仙人掌中截获的线虫为仙人掌孢囊线虫。与其他地区群体(潘沧桑等,1997； Adam,1932; Golden & Raski,1977)相比，日本群体2龄幼虫的b值、口针长和DGO的变化较大，其余测量值的变化相对较小。为了对形态学鉴定结果进行验证，本试验分析了2龄幼虫的28S-D2/D3区的序列和系统发育关系，结果表明该日本群体与仙人掌孢囊线虫的亲缘关系最近，因此将其鉴定为仙人掌孢囊线虫。

寄主植物被仙人掌孢囊线虫侵染后，地上部分表现出生长缓慢、矮化、萎蔫、叶片褪绿等症状，地下根组织出现短小、稀疏、分叉等症状，但不会形成根瘤。仙人掌孢囊线虫的寄主包括仙人掌科Cactaceae、伞形科Umbelliferae、大戟科Euphorbiaceae、景天科Crassulaceae、桑科Moraceae、夹竹桃科Apocynaceae、萝藦科Asclepiadaceae、菊科Asteraceae和木犀科Oleaceae的部分种、属(国家质量监督检验检疫总局，2015)。目前，有关该线虫对寄主植物的危害程度还不清楚，暂未被列入我国进境植物检疫性有害生物名录。

随着我国生态文明建设的推进，大量的种苗和观赏植物通过货物进口、旅客携带和包裹邮寄等途径进入我国。2014年，我国进境邮检截获检疫性线虫4种7批次(张静秋等,2015)，也多次从德国和意大利的邮件中截获仙人掌孢囊线虫。植物线虫通过邮寄渠道入侵我国的风险日益严峻。因此，口岸除了做好进境种苗货检和旅客携带物的检疫外，还需加强对邮寄包裹的检疫。

顾建锋, 王江岭, 邵芳, 高菲菲, 葛建军, 2013. 日本鸡爪槭中苹果根结线虫的鉴定. 植物检疫, 27(1): 43-49.

国家质量监督检验检疫总局, 2015. 仙人掌孢囊属线虫检疫鉴定方法: SN/T 4079—2014. 北京: 中国标准出版社.

罗诺德·佩里, 莫里斯·莫恩斯， 2011. 植物线虫学. 简恒, 译. 北京: 中国农业大学出版社.

毛小芳， 李辉信， 陈小云， 胡锋， 2004. 土壤线虫三种分离方法效率比较. 生态学杂志, 23(3): 149-151.

潘沧桑, 林竞, 薛茹， 1997. 仙人掌仙人掌皮线虫(Cactoderacacti)记述及其扫描电镜观察. 寄生虫与医学昆虫学报, 4(4): 214-217.

谢辉， 2000. 植物线虫分类学. 合肥: 安徽科学技术出版社.

张静秋, 陈克, 严进, 郑明慧, 黄英, 潘绪斌, 朱水芳， 2015. 2010-2014年中国进境邮检截获数据分析. 植物检疫, 29(5): 53-56.

Adam W， 1932. Note surHeteroderaschachtiiSchm., parasite des cactus.BulletinduMuséed′HistoireNaturelledeBelgique, 8: 1-10.

de Man J G, 1884.DifreiinderreinenErdeundimsussenWasserlebendenNematodenderNiederlandischenFauna. Leiden, the Netherlands: Brill.

Duan Y X, Wang D and Chen L J, 2012. First report of the cactus cyst nematode,Cactoderacacti, on cactus in Northern China.PlantDisease, 96(9): 1385.

Esser R P, 1992.CactuscystNematode,Cactoderacacti(NematologyCircular,no. 197). Florida: Florida Department of Agriculture and Consumer Service.

Golden A M and Raski D J, 1977.Heteroderathornein. sp. (Nematoda: Heteroderidae) and a review of related species.JournalofNematology, 9(2): 93-112.

Hall T A, 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98NT.NucleicAcidsSymposiumSeries, 41: 95-98.

Long H, Liu H and Xu J H, 2006. Development of a PCR diagnostic for the root-knot nematodeMeloidogyneenterolobii.ActaPhytopathologicaSinica, 36(2): 109-115.

Subbotin S A, Mundo-Ocampo M and Baldwin J G, 2010.SystematicsofCystNematodes(Nematoda:Heteroderinae). Leiden, the Netherlands: Brill.

Tamura K, Dudley J, Nei M and Kumar S, 2007. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0.MolecularBiologyandEvolution, 24(8): 1596-1599.

(责任编辑:杨郁霞)

Morphological and molecular identification of the plant-parasitic nematodeCactoderacacti, intercepted in shipments ofOpuntiastrictafrom Japan

Hai LONG1,2， Fang-rong LI1, Ying-hui CHENG1, Yong-gui XIE1, Yi-nong LI1*

1ShenzhenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shenzhen,Guangdong518001,China;2ShenzhenKeyLaboratoryofInspectionResearch&DevelopmentofAlienPests,ShenzhenAcademyofInspectionandQuarantine,Shenzhen,Guangdong518045,China

【Background】 In recent years, the number of seedlings imported by parcel post increased sharply， increasing the potential risk of entry of new pests. Shenzhen port has repeatedly intercepted cyst and root knot nematodes from such shipments. 【Method】 In October 12, 2015, Shenzhen port found a kind of cyst nematode in the cactus shipments from Japan. Then the nematodes were identified with morphological methods and 28S rDNA sequence amplification and sequencing. 【Result】 Extracted nematode life forms included females, cysts, juveniles and eggs. Morphological characteristics of the intercepted cyst nematode were basically consistent withCactoderacacti, and the 28S rDNA of which matched well (99% similarity) with those of theC.cactideposited in GenBank (accession number DQ328702). According to the morphological and molecular data, the intercepted cyst nematode was confirmed to be the cactus cyst nematode,C.cacti, so far not known to occure in China. 【Conclusion and significance】 Inspection and quarantine departments need to pay more attention to the parcel post shipments containing plant material. Plant parasitic nematodes identified with the combination of morphological and molecular methods, will yield more accuracy.

Cactoderacacti; quarantine of imported parcel post; morphology; molecular identification

2016-03-04 接受日期(Accepted)： 2016-06-03

龙海， 男， 高级农艺师。 研究方向： 植物线虫检疫。 E-mail: longsi1979@163.com

*通讯作者(Author for correspondence), E-mail: li_yinong@126.com

10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.04.011