非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织EGFR基因突变、miR-25表达与生理生育特征的关系

李晶鑫，张寰，许芳秀,2，王玉，钱碧云,3

(1天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060；2中国人民解放军第401医院；3上海交通大学公共卫生学院)



·论著·

非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织EGFR基因突变、miR-25表达与生理生育特征的关系

李晶鑫1，张寰1，许芳秀1,2，王玉1，钱碧云1,3

(1天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060；2中国人民解放军第401医院；3上海交通大学公共卫生学院)

目的 分析非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织EGFR基因突变、miR-25表达与生理生育特征的关系。方法 130例非吸烟女性肺腺癌患者，收集患者的生理生育信息(年龄、初潮年龄、绝经状态、绝经年龄、活产次数、行经时间)，采用DNA测序技术检测患者肿瘤组织EGFR基因，采用实时荧光定量PCR法检测miR-25表达，采用χ2检验及Logistics回归分析EGFR基因突变与女性生理生育特征的关系，采用Wilcoxon秩和检验分析肿瘤组织miR-25表达与女性生理生育特征关系。结果 130例非吸烟女性肺腺癌患者中71例EGFR基因出现突变，59例仍为野生型EGFR。EGFR基因突变与非吸烟女性肺腺癌患者年龄、绝经状态、绝经年龄、活产次数、行经时间无关(P均>0.05)，与初潮年龄有关(P=0.041)；经多因素调整Logistics回归分析显示，初潮年龄≥14岁的非吸烟女性肺腺癌患者较初潮年龄<14岁者更不易反生EGFR基因突变(OR=0.376，95%CI:0.146～0.970)。肿瘤组织中miR-25的表达与患者年龄及女性生理生育因素均无关。结论 非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织EGFR基因突变与初潮年龄有关；miR-25表达与上述女性生理生育因素均无关。

肺肿瘤；肺腺癌；表皮生长因子受体突变；微小RNA-25

肺癌是发病率及病死率双高的恶性肿瘤，严重危害着人类健康[1]。占肺癌80%的非小细胞肺癌(NSCLC)主要有三种组织学类型：鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，其中腺癌是女性中的常见类型[2]。NSCLC的发生发展是一个逐步累积的过程，目前认为表皮生长因子受体(EGFR)的突变在肺癌中具有原癌基因活性[3]。EGFR基因突变率和人群有直接关系，亚洲人群突变率较高，达到30%[4]。最近的一项研究[5]通过对亚洲7个区域1 450例肺癌患者测序，发现亚洲NSCLC腺癌患者EGFR基因突变率高达51.4%，其中女性突变率高于男性，非吸烟肺腺癌患者EGFR基因突变率达60.7%。miR-25属于miR-106b-25簇，包含miR-106b、miR-25和miR-93，位于MCMT基因第13内含子上[6]。有研究[7]结果推测，miR-25的表达可能与EGFR的突变有关。EGFR与NSCLC临床特征的关系研究目前已较为明确，非吸烟女性肺腺癌患者有较高的EGFR基因突变率[8]。机体中激素水平可以影响女生生理生育因素，同时激素的异常是引起女性多发疾病(如乳腺癌[9]、卵巢癌[10]等)的一种重要因素。目前有观点认为NSCLC，尤其是非吸烟女性肺腺癌的发生与雌激素的作用有关[11]。一项关于新加坡肺癌的研究[12]指出，女性生理生育因素与肺癌发生存在关联。因此我们推测非吸烟女性肺腺癌患者中EGFR的突变可能与女性生理生育因素存在关联，而目前关于此方面的研究仍较为有限。因此本研究观察了非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织EGFR基因突变、miR-25表达与生理生育特征的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经医学伦理委员会批准，肿瘤组织取自天津医科大学肿瘤医院生物标本库收集的130例非吸烟女性肺腺癌患者，患者具有明确的病理学诊断和TNM临床分期。通过查询病历或者问卷调查的方式获得非吸烟女性肺腺癌患者的基本信息及生理生育信息。本研究纳入的130例患者年龄为(57.9±9.8)岁，117例患者初潮年龄为(14.3±1.8)岁，88例患者绝经年龄为(49.8±2.8)岁，87例患者累积行经时间为(35.46±3.15)年，截止调查时，118例患者平均活产次数为2.08次，绝经后91例、未绝经15例。

1.2 肿瘤组织EGFR基因突变观察 采用酚-氯仿抽提方法提取组织DNA，取DNA样本100 ng采用PCR扩增直接观察EGFR第18～21外显子突变情况。琼脂糖凝胶电泳后使用EzgeneTMGel/PCR提取试剂盒(Biomiga公司)对PCR产物进行回收纯化，随后用Big Dye Terminator Cycle测序试剂盒(ABI公司)进行产物扩增测序。以Sequencing Analysis 5.4软件对测序结果进行分析比对。

1.3 肿瘤组织miR-25表达检测 采用实时荧光定量PCR法检测124例非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织中的miR-25。①提取组织RNA：收集样本组织约50 mg，液氮中研磨成粉状；加入1 000 μL的TRIzol试剂裂解；200 μL氯仿抽提，颠倒混匀；加入等体积异丙醇静置沉淀RNA；14 000 r/min、4 ℃离心30 min；弃上清，加入75%乙醇，洗涤RNA，重复1次；将提取出的RNA进行浓度与纯度的测定。RNA原液稀释至50 ng/μL，-80 ℃保存。②逆转录成cDNA：使用TaqMan microRNA逆转录试剂盒进行，反应体系为15 μL，反应条件为16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。③实时荧光定量PCR：采用ABI7900检测系统(Applied Biosystems)，按照TaqMan microRNA试剂说明进行操作。反应条件为95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，50个循环，60 ℃、1 min。内参选择RNU6B。以2-ΔΔCt计算miR-25相对表达量，每样本重复3次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。EGFR基因突变与女性生理生育特征的相关性采用χ2检验及Logistics回归分析。miR-25表达量呈非正态分布，采用中位数表示；其与女性生理生育特征关系采用Wilcoxon秩和检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织EGFR基因突变与生理生育特征的关系 130例非吸烟女性肺腺癌患者中71例出现EGFR基因突变(包括单一突变及多点突变)，59例仍为野生型EGFR。EGFR基因突变与女性年龄、绝经状态、绝经年龄、活产次数、行经时间并无相关性(P均>0.05)，而与初潮年龄有关(P=0.041)，见表1。经多因素调整的Logistics回归分析发现，初潮年龄≥14岁的非吸烟女性肺腺癌患者较初潮年龄<14岁者更不易反生EGFR基因突变(OR=0.376，95%CI:0.146～0.970)。初潮年龄较小可能为非吸烟女性肺腺癌EGFR基因突变的危险因素。

表1 非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织EGFR基因突变与生理生育特征的关系

注：除年龄外，其他参数由于存在缺失值，野生型EGFR和突变型EGFR数量分别少于59、71例。

2.2 非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织miR-25表达与生理生育特征的关系 肿瘤组织中miR-25的表达与患者年龄及女性生理生育特征(初潮年龄、绝经状态、绝经年龄、活产次数、行经年龄)均无关(表2)。

表2 非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织miR-25表达与生理生育特征的关系

3 讨论

肺癌的发病率、病死率在全世界范围内呈上升趋势，超过70%的NSCLC患者确诊时已为晚期，难以进行手术切除治疗[13]。研究[5]证实EGFR在非吸烟女性肺腺癌中有较高的突变率。EGFR目前的治疗多采用吉西他滨等EGFR酪氨酸酶抑制剂，几乎90%的EGFR基因突变对EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感。然而，几乎所有的EGFR基因突变型肺癌最终都会对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性，这给EGFR基因突变型肺癌的治疗带来了重大问题[14]。现多项研究认为EGFR在肺癌的发生发展中与雌激素受体(ER)存在相互作用。Shen等[15]在NSCLC细胞系中联合使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂与芳香化酶抑制剂，发现其能够最大限度抑制肿瘤细胞的增殖。同时研究[16]发现雌激素合成和代谢的相关基因单核苷酸多态性与非吸烟女性肺腺癌患者中EGFR外显子突变相关。He等[17]对NSCLC中EGFR基因突变及雌激素核受体的表达相关性进行了Meta分析，结果显示ER-β表达与EGFR基因突变呈正相关。本研究发现非吸烟女性肺腺癌EGFR基因突变与女性生理生育因素相关，初潮年龄在野生型和突变型EGFR中分布存在差异，是影响EGFR基因突变的重要因素，初潮年龄较小者发生EGFR基因突变的风险更高。这一结果有助于根据患者的特征进行EGFR酪氨酸激酶抑制剂的合理用药及个体化治疗。

miR-25在肿瘤中可能是一个重要的促癌因子[18]。miR-25在肝癌中的高表达能够促进细胞生长，激活表皮间质转化，且受到WNT/β-catenin信号通路的调控。miR-25在NSCLC肿瘤组织及细胞系中表达上调，且靶向调控FBXW7，能够促进细胞的增殖、迁移、侵袭[19]。我们课题组前期报道，非吸烟女性肺腺癌肿瘤组织中miR-25的表达在野生型与突变型EGFR中存在差异，而miR-25在血浆中的表达和EGFR的突变状态不存在关联[20]，这说明miR-25对非吸烟女性肺腺癌EGFR基因突变状态的影响在组织中与血浆中并不一致。一项研究依据原癌基因EGFR、KRAS等基因突变状态在肺腺癌患者中筛选相关miRNA，发现miR-25与EGFR基因突变相关[7]，更加证实了我们的结论。Sakural等[21]进行了乳腺癌相关miRNA的筛选，并识别出了8个miRNA，其中miR-25同乳腺癌ER、孕激素受体表达相关。因此我们可以推测miR-25可能与雌激素相关。我们进行了miR-25表达同女性生理生育因素等特征的关系研究，并未发现各因素与miR-25的表达有关。

可见，非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织EGFR基因突变与年龄、绝经状态、绝经年龄、活产次数、行经时间无关，与初潮年龄有关；miR-25表达与上述女性生理生育特征均无关。

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Relationships between EGFR mutation, MiR-25 expression and female physiology and fertility factors in female patients with non-smoking lung adenocarcinoma

LIJingxin1,ZHANGHuan,XUFangxiu,WANGYu,QIANBiyun

(1TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterofCancer,KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy,Tianjin300060,China)

Objective To investigate the correlations between epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation, expression of miR-25 and female physiology and fertility factors in female patients with non-smoking lung adenocarcinoma. Methods We collected the female physiology and fertility factors (age, menarche age, menopausal status, age of menopause, the number of live births and menstrual period) in 130 female patients with non-smoking lung adenocarcinoma. We detected EGFR mutation by using DNA sequencing technology and the expression of miR-25 by real-time quantitative PCR. The correlations between EGFR mutation, the expression of miR-25 and female physiology and fertility information were detected by chi-square test, Logistics regression and Wilcoxon rank test, respectively. Results There were 71 patients with EGFR mutation, and 59 cases with wild type EGFR in 130 female patients. EGFR mutation was not related with age, menopausal status, age of menopause, the number of live births and menstrual period (allP>0.05), but was related with female menarche age (P=0.041). The adjusted Logistics regression analysis showed that the patients with menarche age more than 14 years old were not more likely to EGFR mutation than those of menarche age less than 14 years old (OR=0.376, 95%CI=0.146-0.970). The miR-25 expression was not related with age, female physiology and fertility factors of patients. Conclusions EGFR mutation is associated with female menarche age in female patients with non-smoking lung adenocarcinoma. However, there is no correlation between the expression of miR-25 and female physiology and fertility factors.

lung neoplasms; lung adenocarcinoma; epidermal growth factor receptor mutation; microRNA-25

国家自然科学基金资助项目(81573231)；天津市自然科学基金资助项目(13JCYBJC23100)。

李晶鑫(1988-)，女，硕士研究生，主要从事肺癌病因学及分子流行病学的研究。E-mail: lijingxin623@163.com

简介：钱碧云(1971-)，女，教授，主要从事肿瘤分子与临床流行病学的研究。E-mail: qianbiyun@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.001

R734.2

A

1002-266X(2016)35-0001-04

2016-04-20)