吉非替尼对非小细胞肺癌细胞PC-9增殖的抑制作用及其机制

吴海洪，李晓娟，莫少伟，庄丽颖

(海南省人民医院，海口 570311)



吉非替尼对非小细胞肺癌细胞PC-9增殖的抑制作用及其机制

吴海洪，李晓娟，莫少伟，庄丽颖

(海南省人民医院，海口 570311)

目的 探讨吉非替尼对非小细胞肺癌细胞PC-9增殖的抑制作用及其机制。方法 将生长状态良好的PC-9细胞随机分为四组，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予1、10、100 μmol/L吉非替尼干预8 h，对照组给予生理盐水。采用MTT法检测各组细胞增殖情况，实时荧光定量PCR法检测细胞凋亡相关因子Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9 mRNA及MEK/ERK信号传导通路相关因子Ras、Raf、MEK、ERK1/2 mRNA表达，免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、Caspase3和Caspase9及通路相关蛋白Ras、Raf、MEK及ERK1/2表达。结果 吉非替尼能够抑制PC-9细胞增殖，且其抑制率随着作用时间延长和作用浓度升高而提高(P均<0.01)；与对照组比较，低、中、高剂量组Ras、Raf、MEK、ERK1/2、Bcl2 mRNA及蛋白表达明显降低，Bax、Caspase3、Caspase9 mRNA及蛋白表达明显升高，且低、中、高剂量组组间两两比较均有统计学差异(P均<0.01)。结论 吉非替尼可抑制PC-9细胞增殖、促进其凋亡；其作用机制可能与抑制MEK/ERK信号转导通路的激活有关。

非小细胞肺癌；细胞增殖；细胞凋亡；吉非替尼；细胞外信号调控激酶

近年来肺癌的发生率和病死率有逐年升高的趋势[1～5]。目前非小细胞肺癌的发病机制尚不明确，且临床上无特效治疗药物。吉非替尼是选择性的表皮生长因子受体抑制剂，对来源于上皮的实体恶性肿瘤具有较好的疗效[6]。2013年1月～2015年3月，我们观察了吉非替尼对非小细胞肺癌细胞PC-9增殖的抑制作用，旨在为其临床应用与新药研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 PC-9细胞购自中国科学院上海细胞所；DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；引物由上海生工协助合成；细胞培养板购自Gibico公司；胰蛋白酶购自Sigma Aldrich公司；兔抗Bax及Bcl2单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗Caspase3及Caspase9单克隆抗体购自美国R&D公司；兔抗Ras、Raf单克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗MEK及ERK1/2单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；吉非替尼购自美国Sigma Aldrich公司；其余试剂为市售分析纯。仪器：荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；全波长酶标仪购自美国Biotek公司；垂直蛋白电泳仪及转膜系统购自美国ABI公司；高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司。

1.2 实验分组及处理 PC-9细胞于5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养至生长状态良好，将细胞随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组细胞数量1×106个。对照组给予生理盐水，低剂量组给予1 μmol/L吉非替尼组培养8 h，中剂量组给予10 μmol/L吉非替尼培养8 h，高剂量组给予100 μmol/L吉非替尼培养8 h。

1.3 PC-9细胞增殖抑制率检测 采用MTT法。将对数期生长的细胞经胰酶消化后用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基悬浮细胞，并接种于细胞培养板于CO2培养箱中培养。各组细胞恢复状态后经相应浓度药物处理后，弃去培养液并加入适量MTT继续于适宜条件下培养。然后在细胞中加入二甲基亚砜并剧烈振荡消化细胞，酶标仪检测培养后细胞培养板各孔的吸光度值(OD值)。细胞增殖抑制率=(对照组OD值-试验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4 细胞凋亡相关因子及MEK/ERK信号转导通路相关因子mRNA检测 采用荧光定量PCR法检测细胞凋亡相关因子Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9 mRNA及MEK/ERK信号转导通路相关因子Ras、Raf、MEK、ERK1/2 mRNA表达。mRNA提取制备及cDNA的逆转录合成过程均严格按照试剂盒说明书进行。荧光定量PCR的扩增条件为：95 ℃变性10 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共扩增35个循环。荧光定量PCR的反应体系为20 μL，其中cDNA模板2 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、2.5×SYBR Green(TianGen)8 μL、超纯水9 μL。引物由上海生工合成。mRNA相对表达量以2-ΔΔCt表示，ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct。

1.5 细胞凋亡相关因子及MEK/ERK通路相关蛋白检测 采用Western blottino法检测细胞凋亡蛋白Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9及MEK/ERK信号转导通路相关蛋白Ras、Raf、MEK及ERK1/2表达。将生长状态良好的PC-9细胞经药物处理后用冰冷的无菌PBS冲洗3次，每次10 min，按照试剂盒说明书提取总蛋白。各组细胞总蛋白提取后与5×SDS混合，并在沸水中煮沸5 min，作为样品制备液。将等量的样品制备液进行垂直的SDS-PAGE蛋白电泳(电泳条件：浓缩胶电压维持70 V，分离胶电压维持80～120 V)，电泳至溴酚蓝移动到PAGE胶底部后停止。小心剥离PAGE胶后采用半干法转膜转至PVDF膜上(转膜条件：电流300 mA，转膜120 min)，用5%脱脂奶粉制备液在4 ℃条件下封闭1 h。将封闭过的纤维素膜与一抗(稀释度为1∶200)在20 ℃条件下充分杂交240 min，PBS冲液漂洗(漂洗3次，每次10 min)；将与一抗杂交后的纤维素膜与二抗(1∶250)杂交，杂交时间为240 min。PVDF膜用无菌PBS漂洗3次后进行显色、定影和拍照。蛋白相对表达量=靶蛋白表达量/内参β-actin表达量。

2 结果

2.1 各组不同时间点PC-9细胞增殖抑制率比较 见表1。

表1 各组不同时间点PC-9细胞增殖抑制率比较±s)

注：与低剂量组比较，*P<0.05，△P<0.01；与中剂量组比较，#P<0.01。

2.2 各组细胞凋亡相关因子及MEK/ERK通路相关因子mRNA相对表达量比较 见表2。

表2 各组细胞凋亡相关因子及MEK/ERK通路相关因子mRNA相对表达量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01；与低剂量组比较，#P<0.05，▲P<0.01；与中剂量组比较，●P<0.01。

2.3 各组细胞凋亡相关因子及MEK/ERK通路相关蛋白相对表达量比较 见表3。

表3 各组细胞凋亡相关因子及MEK/ERK通路相关蛋白相对表达量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01；与低剂量组比较，#P<0.05，▲P<0.01；与中剂量组比较，●P<0.01。

3 讨论

ERK是目前最早发现的丝裂原活化蛋白激酶，该信号通路参与了几乎所有细胞内的生理性及病理性过程，如生长、增殖、转移、分化、发育及凋亡等[9]。MEK/ERK信号转导通路是由一系列关键蛋白参与的，主要包括Ras、Raf、MEK及ERK等[10]。当细胞受到外部刺激后或外部细胞结合到细胞表面受体后，ERK信号转导通路被激活或抑制，并调控细胞核内转录因子表达，进一步影响细胞的生理状态。以往的研究证实，ERK信号转导通路参与了肿瘤细胞的各种生理学过程，如增殖、分化、转移、血管生成以及凋亡过程，并可作为肿瘤治疗的靶点[11]。蔡巧等[12]研究发现，丝裂原活化蛋白激酶的激酶抑制剂CQN能够在体外明显抑制非小细胞肺癌细胞A549的增殖，且能够浓度依赖性地抑制ERK1/2的磷酸化和促进细胞凋亡过程，表现出较强的体外抗肿瘤活性。以往的研究也发现抑制PI3K/AKT和MEK/ERK信号转导通路均能抑制恶性肿瘤血管内皮细胞的水平、垂直和定向迁移，且其抑制作用具有浓度依赖性，同时，PI3K/AKT信号通路对内皮细胞迁移的影响比MEK/ERK信号通路明显。在MEK抑制剂AZD8330对多发性骨髓瘤抗肿瘤作用的初步研究中也证实MEK抑制剂AZD8330可抑制骨髓瘤细胞NCI-H929和IM9增殖，使细胞周期阻滞于G1期，并促进细胞凋亡[13]。细胞凋亡是细胞的程序化的死亡过程，是维系细胞内环境稳定的重要过程，由一系列的细胞凋亡蛋白所介导，如Bax/Bcl2蛋白及Caspase蛋白家族[14,15]。上述细胞凋亡蛋白在多种抗肿瘤药物抑制肿瘤的过程中均表现为激活或表达增强的状态。正常生理状态下的细胞中很少发生细胞凋亡过程，尤其是处于增殖过程的恶性肿瘤细胞的凋亡率较低。因此，促进细胞凋亡是抗肿瘤药物发挥作用的重要机制。

吉非替尼是一种选择性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂[16]，临床主要用于不适合化疗的局部晚期或已经转移的非小细胞肺癌患者。在EGFR基因突变及HER2/HER3蛋白表达水平与吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌疗效关系的研究中发现，对于中国人群，联合检测肿瘤组织中EGFR基因突变及HER2/HER3蛋白表达水平可预测吉非替尼对晚期非小细胞肺癌的疗效[17]。在分析阿法替尼联合西妥昔单抗治疗非小细胞肺癌EGFR T790M突变所致的吉非替尼耐药性的研究中也发现阿法替尼联合西妥昔单抗对EGFRT790M突变所致耐药的非小细胞肺癌原代细胞有效[18]。本研究发现，吉非替尼能够抑制PC-9细胞增殖，且其抑制率随着作用时间延长和作用浓度升高而提高；荧光定量PCR检测发现吉非替尼能够明显增高细胞凋亡因子Bax、Caspase3和Caspase9 mRNA表达，降低Bcl2及MEK/ERK通路MEK及ERK1/2 mRNA表达；免疫印迹法检测显示吉非替尼能明显增高细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase3和Caspase9，降低Bcl2及MEK/ERK通路Ras、Raf、MEK及ERK1/2蛋白表达。

综上所述，吉非替尼可抑制非小细胞肺癌PC-9增殖，促进其凋亡；其作用机制可能是抑制MEK/ERK信号转导通路的激活。

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