剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导技术研究

2016-12-04林轩坤华广西壮族自治区药用植物园广西药用资源保护与遗传改良重点实验室南宁530023

种子 2016年8期

，，，，，林轩，坤华(广西壮族自治区药用植物园，广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，南宁 530023)

剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导技术研究

韦莹，黄宝优，缪剑华，王一诺，李翠，李林轩，韦坤华
(广西壮族自治区药用植物园，广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，南宁 530023)

为了获取质地好且松散型的愈伤组织，为进行剑叶龙血树细胞悬浮培养提供材料。本试验以剑叶龙血树种子、芽为外植体，研究不同培养基、不同激素组合对剑叶龙血树愈伤组织诱导和质地的影响。结果表明：以MS为基本培养基，增加适当浓度的2，4-D和6-BA能促进剑叶龙血树愈伤组织诱导率的提高，长势良好，产生的疏松愈伤组织也最多，最佳疏松愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 1.5～2.0 mg/L。

剑叶龙血树；疏松愈伤组织；诱导技术

剑叶龙血树(Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen) 又名千年木、血竭树、交趾龙血树，是渐危种，属国家二级保护植物[1]。剑叶龙血树具有很高的药用价值，从其树脂提取的血竭被称为麒麟竭，为我国传统名贵中药材，在我国已有1 500年以上的使用历史[2]。据《本草纲目》记载，龙血竭性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经[3]，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血，软坚散结，生肌敛疮等功效，有“活血圣药”的美誉[4-5]，主要分布于云南、广西、海南等地。

近年来，由于其需求量大再加上高昂的价格致使人们对剑叶龙血树野生资源实施了掠夺性采伐，剑叶龙血树野生资源日趋枯竭，濒临灭绝，已被列入国家二类中药保护品种，中国珍稀濒危植物品种之一[6]。因此利用生物技术对其进行组培快繁尤为重要。对剑叶龙血树的研究主要集中在药物化学成分、组织培养[7-8]等方面的研究，目前尚未有细胞悬浮培养方面研究的报道。疏松愈伤组织容易散碎，增殖能力旺盛，有利于愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。本实验通过探究不同激素对剑叶龙血树愈伤组织的影响，筛选出能促进愈伤组织快速生长且质地松散的最佳激素组合，为进一步进行剑叶龙血树细胞悬浮培养提供试验材料，为保护和合理开发剑叶龙血树提供技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料种子采自广西省靖西县。经广西壮族自治区药用植物园黄雪彦老师鉴定该品种为剑叶龙血树(Dracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen)，2011年4月11日于广西药用植物园离体库进行组织培养和种子发芽试验，经过诱导培养获得愈伤组织。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的获得

先用洗洁精水溶液清洗外植体(饱满种子、种子播种于河沙里萌发的芽)表面脏物，再进行流水冲洗5～8 min，移至超净工作台上，用75%酒精将种子和芽浸泡30 s，无菌水冲洗1遍，再用0.1% HgC12浸泡，时间分别为8，12，15 min，无菌水浸泡3次。分别接种于MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培养基上，培养温度为23～27 ℃，光照强度1 500 lx，光照时间为12～14 h/d，30 g/L蔗糖，5.0 g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。培养8～15 d便开始出芽(图1，图2)，并逐渐长出无菌苗。

1.2.2 愈伤组织的诱导

将无菌苗剪切成0.8～1.2 cm的带芽茎段，接种于MS基本培养上，培养基分别附加不同浓度配比的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和6-BA(6-苄氨基嘌吟)2种植物激素。通过设计10个处理试验，筛选出诱导剑叶龙血树疏松愈伤组织的最佳激素组合，经培养40 d后统计诱导结果。

图1 种子消毒诱导

图2 种子诱导出芽

1.2.3 继代培养

将培养25～30 d的愈伤组织接种到MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基中进行继代培养，每隔1个月转接1次，接种时切除黑色、褐化或者已失去活力的愈伤组织，挑选长势好的组织进行培养，连续继代5次。

1.2.4 统计方法

诱导率(%)=形成愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块数×100%;

褐化率(%)=褐化的愈伤组织块数/接种的愈伤组织总数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对剑叶龙血树愈伤组织诱导的作用

以无菌芽为外植体，在添加NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L激素的MS、B 5、N 6三种基本培养基上进行诱导。培养40 d后观察发现，培养初期(15 d)各处理愈伤组织变化差异不大，培养30 d后3个处理的愈伤组织在生长速度、颜色等方面逐渐出现差异。由表1可见，MS培养基的愈伤组织诱导率最高，为62.9%，褐化率也相对最低，愈伤组织生长旺盛、结构疏松；其次为B 5培养基，而以N 6为基本培养基的愈伤组织诱导效果最差，愈伤组织诱导率最低，颜色浅黄、愈伤组织质地紧密，褐化率也最高。因此认为，MS培养基较适合剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导。

表1 MS、B 5、N 6培养基对剑叶龙血树愈伤组织诱导的影响

培养基愈伤组织诱导率(%)褐化率(%)颜色长势MS62．917．1绿色，乳白色生长较快，疏松型愈伤组织较多B557．131．4绿色，少量浅黄色生长速度一般，愈伤组织较疏松N651．445．7少量绿色，浅黄色生长慢，愈伤组织质地紧密

2.2 疏松愈伤组织诱导培养基筛选

本实验采用不同浓度6-BA和2，4-D相结合的方法对剑叶龙血树愈伤组织进行诱导，结果见表2。

表2 6-BA、2，4-D不同浓度及组合对剑叶龙血树愈伤组织诱导的影响

激素及浓度(mg/L)6⁃BA2，4⁃D愈伤组织诱导率(%)疏松程度颜色0．10．568．6++绿色0．50．574．3++淡黄色，乳白色1．00．577．1++浅绿色，部分淡黄色1．50．571．4+嫩绿2．00．568．6+绿色0．50．165．7+浅绿色0．51．080．0++绿色0．51．588．6+++乳白色、嫩绿色0．52．085．7++++浅绿色、乳白色0．53．082．9++绿色，淡黄色

在上述10个处理的诱导培养基上，经培养10 d后，外植体切口端开始膨大，培养半个月逐渐形成愈伤组织。经过培养40 d后统计愈伤组织诱导率及长势等各指标。从表1可以看出，不同植物激素组合对愈伤组织的诱导率、质地及色泽均有较大差异。在2个激素组合处理中，当2，4-D浓度固定为0.5 mg/L时，随着6-BA浓度的增长，剑叶龙血树愈伤组织诱导率在很小幅度上逐渐上升，质地变得更紧密、颜色也产生相应的变化，在6-BA浓度为1.0 mg/L时，愈伤组织诱导率达最高，为77.1%，但质地和颜色指标效果不是最佳，从细胞悬浮培养材料需要来看，浓度在0.5 mg/L时较为适宜。而在同一6-BA浓度作用下，高浓度的2，4-D愈伤组织诱导率相对均较高，颜色变化不规律，愈伤组织质地由紧密逐渐疏松(图3，图4)。这一结果说明,在诱导愈伤组织时，高浓度的2，4-D能促进愈伤组织的生长，其中，以激素组合为MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 1.5～2.0 mg/L对愈伤组织诱导最好，愈伤组织诱导率可达85%以上，产生的愈伤组织生长旺盛，大部分为嫩绿色、颗粒状的愈伤组织。

图3 紧密愈伤组织

图4 颗粒状、疏松型愈伤组织

3 结论

不同种类培养基对剑叶龙血树愈伤组织诱导和生长有着重要的作用。本实验分别采用MS、B 5和N 6三种培养基，这3种培养基均能诱导出愈伤组织，MS培养基中愈伤组织诱导率最高，且褐化率最低，可能是由于其具有较高的无机盐浓度，能够提供组织生长所需的矿质营养，从而加速愈伤组织的生长。B 5培养基的主要特点是含有较低的铵，铵这一营养成分有可能对培养基有抑制生长的作用，因而愈伤组织诱导率相对较低。N 6培养基特点是KNO3和(NH4)2SO4含量高，褐化严重。未添加2,4-D的条件下，B 5和N 6培养基与6-BA和NAA相结合能诱导产生愈伤组织，但生长缓慢，愈伤组织质量差，因此不是最佳选择。

生长速度快、疏松易碎的愈伤组织是进行植物细胞悬浮培养的关键[9]。一般选用颗粒细小、疏松易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织作为细胞悬浮培养的材料[10]。本研究采用剑叶龙血树种子和芽作为外植体，采用MS基本培养基附加不同浓度的2,4-D和6-BA激素组合诱导剑叶龙血树愈伤组织，结果表明，激素种类和浓度对剑叶龙血树愈伤组织的诱导效果有一定的影响，2，4-D不仅有利于促进诱导外植体产生愈伤组织，而且浓度不同质地也存在差异，经试验比较认为激素组合MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5～2.0 mg/L诱导效果最佳，在该培养基上产生的愈伤组织生长速度较快，质地疏松。培养30 d后转接到继代培养基中培养，长势良好。

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Study on the Loose Callus Induction Technology ofDracaenacochinchinensis(Lour) S.C.Chen

WEIYing,HUANGBaoyou,MIAOJianhua,WANGYinuo,LICui,LILinxuan,WEIKunhua