不同地域马尾松优良无性系ISSR遗传多样性分析

， ， ， ， ， ， (.贵州大学，农业生物工程研究院/生命科学院，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室， 贵阳 00；.贵州大学，贵州省森林资源与环境研究中心， 贵阳 00；.贵州都匀国家林木良种基地， 贵州 都匀 8000； .广西林科院， 南宁 0000；.福建省龙岩市马尾松研究中心， 福建 龙岩 6000)

不同地域马尾松优良无性系ISSR遗传多样性分析

崔博文1,2，范付华2，丁贵杰2，谢维斌3，杨章旗4，洪永辉5，文晓鹏1
(1.贵州大学，农业生物工程研究院/生命科学院，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室， 贵阳 550025；2.贵州大学，贵州省森林资源与环境研究中心， 贵阳 550025；3.贵州都匀国家林木良种基地， 贵州 都匀 558000； 4.广西林科院， 南宁 530000；5.福建省龙岩市马尾松研究中心， 福建 龙岩 364000)

采用ISSR分子标记技术，对贵州都匀、广西南宁及福建漳平马尾松良种种子园内的132个优良无性系进行了遗传多样性分析。结果表明，以筛选出的稳定性强、多态性丰富及条带清晰的12条ISSR引物进行PCR扩增，共获得185条谱带，其中多态性谱带为183条，多态性比率高达98.9%；引物UBC 840标记指纹能区分18份马尾松红心材种质材料；聚类分析显示，供试种质的遗传相似性系数为0.57～0.90，表明供试马尾松种质遗传多样性丰富；以相似性系数0.68为阈值，可将其大致按地域分为3大类，且同一地域内种质聚类结果与特异性状一致。

马尾松； 无性系； ISSR； 遗传多样性

表1 132个马尾松优良无性系来源、编号及其优势性状

种子园优良性状 无性系编号都匀国家林木良种基地速生都118、都51、都59、都95、都98、都53、都99、黄15、黄29、黄47、黄23、黄6、黄49．1、黄13、开1．1、福5．1、岑11×黄13、岑17×黄28、三3×黄26、黄15×黄39、岑15×黄26、黄14×黄4、岑11×黄26、黄14×黄13、三1×黄28、黄15×岑1、岑16、黄24、福3、黄10、黄38、黄49、黄17福建漳平五一林场高产脂G67、G1、G18、G15、G63、G8、G28、G51、G71、G60、G61、G56、G78、G50、G57红心材H28、H93、H58、H90、H92、H59、H62、H71、H7、H16、H28、H48、H54、H22、H43、H49、H85、H15速生70⁃80⁃5、大田1号、70⁃71⁃4、80⁃72⁃3、78⁃57⁃4、70⁃80⁃4、74⁃75⁃3、74⁃74⁃4、83⁃86⁃4、1975⁃7⁃5、70⁃72⁃2、90⁃29⁃4、662、90⁃70⁃4、393、227、13、335、1、691广西林科院种子园速生34⁃1、42⁃1、40⁃2、41⁃1、43⁃1、224、35⁃1、39⁃1、30⁃1、27⁃1、28⁃1、26⁃1、37⁃1、38⁃1、36⁃1、541⁃2⁃9、541⁃3⁃2、541⁃3⁃6、541⁃3⁃4、541⁃3⁃3、541⁃2⁃1、541⁃2⁃3、541⁃3⁃9、541⁃2⁃5、631⁃1⁃10、631⁃1⁃9、631⁃1⁃8、63、1⁃1⁃6、631⁃1⁃3、631⁃2⁃8、631⁃2⁃1、631⁃2⁃3、333⁃1高产脂333⁃1、334⁃1、344⁃1、343⁃1、346⁃1、338⁃1、331⁃2、301⁃1、335⁃1、300⁃1、352⁃2、348⁃1、349⁃1、351⁃1

马尾松(PinusmassonianaLamb.)以其分布广、适应能力强、速生、丰产、全树综合利用程度高等优良特性，成为我国南方最主要优质针叶用材树种之一，其用材林面积居全国之首，松脂产量高，在我国森林资源发展、林纸一体化、松香林产化工业及森林生态服务功能中具有重要地位。马尾松是一个种内杂种优势较为明显的树种，对不同来源马尾松遗传多样性及遗传结构进行研究，将为高世代育种提供理论指导[1]。

分子标记不受个体发育和环境的影响，已广泛用于植物遗传多样性、遗传结构及亲缘关系分析。尽管利用分子标记揭示马尾松遗传多样性有诸多报道[2-5]，但主要集中于单一种子园优良无性系或育种亲本的研究，不足以解析不同地域种子园间马尾松遗传结构及遗传多样性的实质。以3个省区良种基地种子园不同优良性状的马尾松无性系为供试材料，利用ISSR标记揭示我国马尾松群体遗传结构、亲缘关系及无性系遗传多样性，旨在为今后种子园的营建和遗传改良提供可靠的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

实验材料为贵州都匀国家林木良种基地、福建漳平五一林场及广西林科院国家一代种子园中随机采取的132个马尾松优良无性系，供试材料都表现出一定的速生性，部分无性系还兼有高产脂或红心材等优良性状(表1)。采集无性系幼嫩针叶，经液氮处理后，于-80 ℃保存备用。

1.2 DNA提取及检测

取-80 ℃下保存的鲜嫩针叶，利用天根生化科技有限公司试剂盒(DP 320-02)提取基因组DNA。经0.8%琼脂糖凝胶电泳(GoldViewⅠ染色)和紫外分光光度计检测其质量和浓度后稀释DNA至20 ng/μL，备用。

1.3 PCR扩增及检测

采用了来自于已发表文献的106条ISSR引物序列(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，从中筛选出合适的引物及其最佳退火温度。PCR反应体系及程序借鉴范付华等[6]的方法，筛选出合适的引物及反应条件(表2)。取5μL反应产物，在含有GenGreen核酸染料(10 000×DMSO)的1.6%琼脂糖凝胶中，以5 V/cm的电压电泳50 min，然后于紫外凝胶分析仪中观察，并拍照保存。

表2 用于PCR扩增的12条ISSR引物及其扩增结果

引物序列(5’→3’)扩增谱带数多态性谱带数退火温度(℃)UBC808(AG)8C151557UBC825(AC)8T161656UBC827(AC)8G212157UBC836(AG)8YA161654UBC840(GA)8YT171657UBC841(GA)8YC191954UBC848(CA)8RG181852UBC854(TC)8RG9954UBC861(ACC)6141462UBC868(GAA)6141456UBC873(GACA)4131254M08(AGC)4AY131357

注：Y=(C,T);R=(A,G)。

1.4 数据处理及分析

对每条引物进行3次扩增，选择重复、清晰、能够准确辨识的谱带进行统计。按“引物号-片段长度”记录相关信息，并按同一位置谱带的有无分别赋值“1”和“0”，数值矩阵后用NTSYSpc 2.10 e软件计算其相似性系数，以UPGMA法构建亲缘关系树状图，并进行主坐标分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR扩增多态性分析

以12条对ISSR引物，对132份供试马尾松基因组进行了PCR扩增。图1为引物UBC 840对部分种质的PCR扩增图。结果(表2)表明，扩增谱带大小为200～2 000 bp，12条引物共获得185条谱带，平均每一引物可获得15.4条，其中多态性谱带183条，多态性比率高达98.9%。扩增谱带最多的引物为UBC 827，共21条带，而UBC 854扩增的谱带最少，仅为9条；除了引物UBC 840、UBC 873扩增的谱带多态性比率分别为94.1%和92.3%外，其余引物获得的多态性比率均为100%。

图1 引物UBC 840对部分材料的PCR扩增图谱

2.2 红心材种质的DNA指纹鉴定

马尾松红心材是前人在定向选育中发现的优良变异类型，具有较高的经济价值。对18份马尾松红心材种质进行ISSR图谱分析，发现不同引物产生的谱带数及多态性存在很大差异(表3)。采用引物UBC 840的标记信息构建了红心材种质的指纹图谱，其中UBC 840-1000、UBC 840-500和UBC 840-400为共性谱带，在所有供试红心材中均存在，其余的14条谱带在不同材料中表现出了明显的多态性，即所有供试红心材种质的特征指纹各不相同，由此建立的DNA指纹图谱能将其完全区分开来。

2.3 遗传多样性评价与聚类分析

利用ISSR标记信息计算出供试马尾松种质的SM遗传相似性系数，结果表明，132份种质间的相似系数在0.57～0.90之间，显示出丰富的多样性。对各个地理居群内样品之间的遗传相似性系数分析，都匀居群平均值为0.74，漳平居群平均值为0.69，南宁居群平均值为0.76。由此可知，来自福建漳平五一林场的马尾松种质间遗传差异较大，遗传多样性较其它供试无性系群体更为丰富。

基于UPGMA法构建的聚类图显示(图2)，以相似性系数0.68为阈值时可将供试材料分为3大类，第1大类全部为都匀林场的16个速生无性系；都匀林场另外17个无性系与采自福建漳平五一林场的所有材料聚为第2大类，其中五一林场的供试材料包含速生、高产脂和红心材三大优良性状；第3类全部为来自于广西南宁的46个不同优良性状的马尾松无性系。由此可见，来源于同一地理种群内的马尾松无性系亲缘关系更近。若以相似系数为0.70为阈值，可将第2大类五一林场的53个无性系聚为3亚类，第1亚类全为红心材，第2亚类包含全部的高产脂种质及49号和50号红心材种质，其余速生型种质聚为第3亚类。而第3大类的广西材料，除了个别种质外，也可基本按照高产脂和速生性状进一步分为2个亚类。这表明，同一地域内种质性状趋异与DNA水平上亲缘关系的远近有很大的相关性。值得注意的是，第2大类中都匀林场17个速生无性系与五一林场速生群体并未聚在一个亚类中，而与供试的红心材亲缘关系较近，说明不同地域马尾松无性系群体亲缘关系远近与性状差异相关性较低。

表3 18份马尾松红心材的特异性指纹

编号特异性分子指纹ABCDEFGHIJKL491010111000105011101011100051100010000000521100111101005310110010101054111111101001551110111010005610101100100057000001100000580010110010005911111110100060000011101000611011100000006201111111000063111011101110641111110111016511101101100066111011001000

注：A～L分别表示指纹UBC 840-2000、UBC 840-1800、UBC 840-1600、UBC 840-1500、UBC 840-1200、UBC 840-1000、UBC 840-750、UBC 840-650、UBC 840-575、UBC 840-475、UBC 840-350、UBC 840-250。样品编号顺序同表1。

图2 132份马尾松无性系的ISSR聚类图

2.4 NTSYS-PCA主坐标分析

基于遗传相似性系数，利用NTSYS-pc 2.1软件对供试马尾松材料进行主坐标分析(图3)。将位置靠近的马尾松划归在一起，可将132份供试材料大致按地域分为3大类。其中位置相靠近者表示遗传一致度高，在指导种子园建设时应综合考虑，任选其一即可；位置远离者表示遗传关系疏远，种质特异性高，可作为高世代亲本选择的重点对象。主坐标分析结果于UPGMA法构建的树状聚类分析结果基本一致，来源于同一种子园的材料能较好地聚为一类，且同一种子园内相同特异性状的种质紧密聚在一起，亲缘关系最近，主成分分析结果更直观地表明了不同马尾无性系之间的亲缘关系。

图3 132份马尾松无性系的NTSYS-pc主坐标分析

3 讨 论

分子标记因其不受取材部位、时间以及环境等因素的影响，能真实反映植物材料之间的基因组差异，已被广泛应用于指纹图谱构建、遗传多样性分析、基因定位及分子辅助选择育种等诸多方面。ISSR分子标记技术兼具RAPD和SSR优点，是一种数据可靠、可提供丰富位点信息、操作简捷快速的DNA指纹技术[7]，已在多种林木上得到广泛应用[8]，是植物种质资源评价及鉴定的重要技术手段。张薇等利用SSR标记对马尾松实生种子园进行遗传多样性分析，结果表明，种子园子代群体具有较高的遗传多样性，并对林木育种理论丰富与实践应用均具有重要意义[9]。与用于马尾松研究的其它分子标记相比，ISSR能够扩增出更多条带，且多态性丰富，被认为更适合马尾松遗传多样性的分析[10]。本实验采用12条ISSR引物，对3个不同省区种子园的132份马尾松种质进行PCR扩增，结果表现出丰富的多态性，种质间存在明显的遗传差异。从分子水平来看，供试种质间遗传相似系数越小，表明其遗传分化越大；遗传多样性高低，反映遗传背景的复杂程度及该物种进化历史[11]。供试马尾松遗传相似性系数范围在0.57～0.90之间，体现了种质间遗传差异的实质，也一定程度上印证了马尾松悠久的栽培历史。

地理位置与环境效应，一向被认为在植物种质演化中起重要作用，起源于同一地区的半野生材料往往聚在一起[12]。李志辉等对广西马尾松天然林古蓬和浪水种源群体的遗传多样性分析表明，种源内群体间存在比较高的近亲交配现象[13]。本研究聚类结果显示，除了17份采自都匀林场的马尾松无性系外，其它材料都严格归属于3个地理来源的群体系统，表明不同地域马尾松无性系群体间遗传背景保持一定的独立性，也可以反映出早先马尾松种子园基本是按照地域特色、就近取材的原则而建立的。遗传多样性是生物携带遗传信息的总和，是植物选育及研究中最有价值的物质基础[14]。因此，在建立二代或高世代种子园时，应适当从其它种源或远缘地域筛选优良家系作为建园亲本，以增加该种子园的遗传多样性。

马尾松分布广，存在历史久，在长期的自然选择过程中，产生了广泛的遗传变异，红心材便是变异类型之一。马尾松红心材变异系数小，色泽美观，市场价值高，但随着天然成、过熟林不断被大量采伐，红心材类型已极为罕见[15]。本实验采用1条ISSR引物，构建了18个红心材种质的DNA指纹图谱，能将这些供试马尾松完全区分出来，进一步证实ISSR标记能够有效用于马尾松的种质鉴定。聚类图及主坐标分析表明，同一地域内具有相同特性的马尾松材料基本聚为一类。由此可见，决定马尾松优良利用特性(速生、高产脂、红心材)的遗传基础差异较大，利用ISSR标记进行马尾松亲缘关系的分析是高效可行的。张一等对马尾松亲本遗传聚类与子代杂种优势相关分析发现，随着亲本间ISSR遗传距离的增大，子代生长性状的远缘交配优势呈线性增加[16]。至于ISSR标记信息与马尾松产脂量及红心材比例等性状间的遗传关系尚待进一步研究。

[1]张一,谭小梅,周志春,等.马尾松二代育种亲本主要生长性状和ISSR遗传变异[J].分子植物育种,2010,8(3):501-510.

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[4]李广军,郭彩萍,郭文娟.广西古蓬种源马尾松遗传多样性的ISSR分析[J].中南林业科技大学学报,2011,31(9):42-45.

[5]谭小梅,周志春,金国庆,等.马尾松二代无性系种子园遗传多样性和交配系统分析[J].林业科学,2012,48(2):69-74.

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[15]阮少宁.马尾松红心材变异类型分析及选择研究[D].福建:福建农林大学,2004.

[16]张一,周志春,金国庆,等.马尾松双列杂交亲本遗传距离与杂种生长优势相关性分析[J].南京林业大学学报(自然科学版),2010,34(1):9-14.

Genetic Diversity of Massonpine (Pinusmassoniana) Excellent Clones from Different Areas as Revealed by ISSR Markers

CUIBowen1,2,FANFuhua1,DINGGuijie2,XIEWeibin3,YANGZhangqi4,HONGYonghui5,WENXiaopeng1
(1.The Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education),Institute of Agro-bioengineering and College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025，China;2.Research Center for Forest Resources and Environment of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025，China;3.State Forest Farm in Duyun,Duyun Guizhou 558000，China;4.Guangxi Academy of Forestry,Nanning 530000，China;5.Research Center of masson pine in Longyan,Longyan Hujian 364000，China)

Currently,ISSR markers were used to elucidate the genetic diversity of 132 clones of masson pine (Pinusmassoniana) from the different seed orchards.A total of 185 bands were yielded from the 12 primers,which were screened based on their polymorphism,clearness and reproducibility.In total,185 ISSR bands were obtained,and 183 were polymorphic (98.9%).The specific markers generated from UBC 840 might effectively distinguish the tested 18 red heart-woods germplasms.The genetic diversity coefficient among the accessions ranged from 0.57 to 0.90,reflecting the high genetic diversity of tested masson pine germplasms.Three groups were obtained roughly when 0.68 as a threshold,and the clustering result of the germplasms within the same orchard was consistent with that of the specific traits.

masson pine; clone; ISSR marker; genetic diversity

2016-05-15

贵州省重大专项(编号：20126011-1)；863计划(编号：2011 AA 10020301)。

崔博文(1984—)，博士研究生，主要从事森林培育研究；E-mail:hbqhd16cuibowen@163.com。

文晓鹏，博士，教授，主要从事林木生物技术与遗传育种研究；E-mail:xpwensc@hotmail.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.09.041

S 791.248

A

1001-4705(2016)09-0041-06