高抗烟草花叶病毒的烟草种质资源筛选

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(云南省烟草农业科学研究院/烟草行业烟草生物技术育种重点实验室/ 国家烟草基因工程研究中心， 昆明 650021)

·资源与利用·

高抗烟草花叶病毒的烟草种质资源筛选

刘勇，许美玲，黄昌军，李梅云，李永平

(云南省烟草农业科学研究院/烟草行业烟草生物技术育种重点实验室/ 国家烟草基因工程研究中心， 昆明 650021)

为了解我国烟草种质资源对烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)的抗性状况，为烟草抗病育种的亲本选择提供信息，本试验通过苗期TMV汁液摩擦接种，对1 191份烟草种质资源进行了TMV抗性鉴定。筛选出的对TMV表现为枯斑反应的高抗资源有：白肋烟40份、国内烤烟20份、国外烤烟28份、晒烟1份，合计89份。接种后21 d表现为花叶的资源有：白肋烟29份、国内烤烟430份、国外烤烟270份、国内晒烟352份、国外晒烟(雪茄烟)21份，合计1 102份。枯斑资源的比例白肋烟gt;烤烟gt;晒烟。云南省烟草农业科学研究院2006年保存白肋烟、烤烟和晒烟资源合计1 652份，本试验较系统的鉴定了72%种质资源的TMV抗性状况，可为种质资源的育种利用提供参考。

烟草； 种质资源； 烟草花叶病毒； 抗性

烟草花叶病毒病(Tobaccomosaicvirus,TMV)是我国烟草上的重要病害，每年造成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列[1-2]。种植抗病品种是防控TMV最根本和最经济有效的手段，但我国主栽品种云烟87、云烟97、K 326、中烟100和红花大金元等均不抗TMV。我国选育高抗TMV的系列品种，如：CV 85、CV 87、辽烟8号、辽烟13号、辽烟14号和龙江912等常规种[3-4]；如：云烟201，云烟202，云烟203和云烟205和辽烟15号等杂种1代[5-8]，并引进了美国和巴西高抗TMV的杂种1代，如：NC 297、NC 102、PVH 09等[9]。但因为连锁累赘或品种适用性等原因，这些高抗TMV品种的推广面积不大。在TMV病害持续高压的态势下，选育高抗TMV且无产量劣势和缺点(如：落黄慢和难烘烤)的品种具有重大意义。优良抗源是选育高抗且丰产优质品种的关键之一。烤烟品种TMV抗性主要来源于烟草野生种心叶烟(Nicotianaglutiosa)，其抗性由1个显性单基因(N)控制[10]。通过一系列的常规杂交和回交转育，N基因的抗性从心叶烟转育至香料烟中，然后转育至白肋烟和烤烟品种中[11-14]。

目前我国用于选育抗TMV烤烟品种的抗病亲本(携带N基因)数量少，主要有9501、8022、Coker 176、Ky 56、Coker 86、CV 58、CV 87、KX 13等[6-8,15]。我国收集保存了4 000多份烟草种质资源，据不完全统计，对约1 000份种质资源(包含重复鉴定资源)开展过TMV抗性鉴定，已鉴定出76份高抗TMV的种质资源[16-23]，仍有大量资源的TMV抗性不明。已育种利用的TMV抗源数量少、大量种质资源抗性不明成为烟草抗TMV育种的制约因素之一。不同的种质资源与N基因连锁的累赘大小不同。在种质资源库中筛选新的连锁累赘相对较小的高抗资源，可为选育出抗性和农艺性状兼优的新品种提供新抗性供体亲本。本文通过苗期摩擦接种，对云南省保存的1 182份烟草种质资源进行了TMV苗期接种抗性鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

云南省烟草农业科学研究院收集保存的烟草种质资源1 191份(见表1)。TMV毒源为TMV普通株系。

1.2 试验方法

在云南省烟草农业科学研究院研和试验基地防虫塑料大棚内进行。按常规方法漂浮育苗，在162孔漂浮盘中每份定植18株，苗龄60 d左右，采用高压喷枪摩擦接种TMV。采集经免疫检测试纸条检测为TMV的新鲜病叶，在无菌研钵中，用接种缓冲液(0.01 mol/L pH=7.0磷酸盐缓冲液)研磨，用双层纱布过滤，调整接种液的浓度为1∶1 000 重量体积比，在病毒汁液中加入1%过孔径0.075 mm筛孔的化学纯二氧化硅。高压喷枪喷射压力为1 kg/cm2，喷枪口距离接种物 20 cm，每株喷射接种时间约为0.5 s。接种后立即用喷壶喷少量自来水，提高接种效率。

表1 高抗TMV枯斑资源名录

类 型 名 称数量(份)国内近10年文献未报道的枯斑资源(份) 白肋烟B21(不育系)，B21(叶形椭)，B21(皱叶)，B22，B49，B64，Banket⁃A⁃1，BG4，BYS，Ergo，K10，K14，KY10，KY12，KY41A，KY14，KY15，KY17，KY171，KY56，Ky8959，Ky8959(BC4)，KY9，Ky907(BC4)，Ky908，MSB21，MSKY10，MSKY14ΧL8，NC3，TN90，TN97，Va1048，WB68，引巴1，Msky17，MSTN90，MBN2，MSBurley21×KY14，NC7，EMH144036 国内烤烟大白筋2518，辽烟9号，辽烟13号，辽烟14号，牡单80⁃7，牡单81⁃56，台烟5号，台烟6号，中卫一号，6349，7915，8100，8211，8212，78⁃3013，8902⁃42，9501，B09，CV85，CV87207 国外烤烟RT32，Coker86，巴引一号，Echague，ETWM10，H423，MRS⁃3，NC567，NC628，NC86，PVH01，PVH02，PVH05，PVH06，PVH07，PVH08，RGH04，RGH12，SC71，SC72，Vamorr48，Virginia3160，Virginia645，Virginia770，Virginia80，Virginia(1)，WE⁃12，朝鲜抗赤2811 晒烟Va87811 合计8955

注：加下画线的为国内近10年文献报道的高抗TMV资源。

1.3 病情调查与抗性划分

接种后第5天、第7天调查接种叶是否有枯斑；接种后10，14，21 d调查花叶症状发生情况，以株为单位，计算枯斑率和花叶发病率。为分析个别材料因为接种效率、死亡等原因造成的数据缺失，根据枯斑率和花叶发病率划分抗性，高抗(枯斑)：枯斑率大于90%；感病：花叶发病率大于90%。枯斑率或花叶率小于90%的资源，不作抗性划分，有待于重复鉴定。

2 结果与分析

2.1 不同类型资源中抗TMV的枯斑资源

对1 182份烟草种质资源苗期人工接种TMV，筛选出高抗TMV枯斑资源89份，分别为白肋烟40份，国内烤烟20份，国外烤烟28份，晒烟1份(表1)。与国内近10年文献报道相比，新鉴定出高抗TMV枯斑资源55份，分别为白肋烟36份，国内烤烟资源7份，国外烤烟资源11份，晒烟资源1份(表1)。接种TMV后表现为花叶的资源(感病)共1 102份，分别为白肋烟29份，国内烤烟430份，国外烤烟270份，国内晒烟352份，国外晒烟(雪茄烟)21份(未列出数据)。

2.2 不同类型资源中抗TMV枯斑资源的分布

在鉴定的1182份资源中，根据地理来源和工业使用类型划分的国内烤烟、国外烤烟、国内晒烟、国外晒烟和白肋烟等五大类型中，枯斑资源的比例存在明显差异。枯斑资源的比例白肋烟gt;烤烟gt;晒烟(表2)。根据2006年统计[24]云南省烟草农业科学研究院保存白肋烟95份，国内烤烟648份、国外烤烟483份，国内晒烟395份，国外晒烟31份，合计1 652份。本试验鉴定了1 191份，占保存资源的72%。

表2 5种类型资源中抗TMV枯斑资源的比例

资源类型云南院保存资源数量(个)鉴定资源数量(个)枯斑资源数量(个)枯斑资源比例(%)平均枯斑资源比例(%)白肋烟95694057．9757．97国内烤烟648450204．44国外烤烟483298289．406．42国内晒烟39535200．00国外晒烟312214．550．27合计/平均16521191897．47

3 讨 论

为减少工作量，本试验将抗性划分简化为高抗(枯斑资源)、感病(接种后21 d表现为花叶)两大类。《烟草品种抗病性鉴定》国家标准[25]，根据苗期人工接种TMV的病情指数，将鉴定材料的抗性划分为6个档次，其中抗性最高的档次为高抗或免疫(表现枯斑)，其他5个档次为抗病至高感。本试验在漂浮苗盘中烟苗4～5片叶时，高压喷枪接种TMV病叶汁液1 000倍稀释液后，无枯斑的资源发病迅速，生长缓慢。接种后14 d或21 d调查时，烟株总叶片数较少，几乎全部叶片表现花叶。因此，根据病害分级标准调查，资源间的病级和病情指数差异较小。目前国内外烟草抗TMV育种主要利用N基因。本试验简化的抗性划分方法，能高效鉴定出携带N基因的枯斑资源。

与国内近10年文献报道[16-23]比较，本试验新鉴定出枯斑资源55份，55份枯斑资源中包含少数被报道为抗病的资源。有文献将病情指数为0的资源划分为免疫(枯斑)、病情指数小于10的资源划分为抗病。少数被其他文献鉴定为抗病(病情指数小于5)的资源，本试验鉴定为高抗TMV的枯斑资源。可能原因为：这些文献在田间或盆栽接种鉴定时，个别植株自然感染了其他引起花叶的病毒病，肉眼调查难以剔除其他病毒的污染。在防虫塑料大棚苗期接种，降低了其他病毒的污染。本试验同时调查了同一资源的枯斑率和花叶发病率，相互验证结果。对枯斑率或花叶率小于90%的资源、有枯斑且有花叶病株的个别资源、非N基因介导的抗TMV资源(如：无症状资源)，未作定性评价，需要另行鉴定。如需要精细区分接种后21 d表现为花叶资源的抗性差异，则需要移栽后接种鉴定。由于部分文献仅列出抗病的资源名称，未列出全部供试的资源名称。因此，难以准确统计新鉴定的资源数量，保守估算新鉴定的资源数量不少于500份。云南省烟草农业科学研究院2006年保存白肋烟、烤烟和晒烟合计1 652份(许美玲，2006)，本文较系统地鉴定了1 191份，占保存资源的72%。

本试验结果表明，白肋烟、烤烟和晒烟3种类型烟草中枯斑资源的比例白肋烟gt;烤烟gt;晒烟，抗TMV种质资源筛选，宜以烤烟和白肋烟为重点。枯斑资源的比例与抗TMV育种历史相吻合。N基因来源于野生种心叶烟[10]，通过一系列的常规杂交和回交转育，N基因的抗性从心叶烟转育至香料烟中，然后转育至白肋烟和烤烟品种中[11-14]。由于产量较低、上部叶落黄较慢等连锁累赘，NN基因型的品种，推广种植面积较小。目前主要采用Nn基因型的杂种一代。Nn基因型品种比NN基因型的产量和产值高，接近于nn基因型品种[26]。白肋烟中N导入片段引起的连锁累赘较小[27]，历史上选育与推广的抗TMV白肋烟品种较多，烤烟N导入片段引起的连锁累赘较大[28]，选育与推广的抗TMV烤烟品种相对较少。国内晒晾烟主要为地方性的农家品种，收集保存的资源数量较多。我国历史上很少开展系统性的晒烟育种，因此，国内抗TMV晒晾烟数量稀少。

[1]陈瑞泰,朱贤朝,王智发,等.全国16个主产烟省(区)烟草侵染性病害调查报告[J].中国烟草科学,1997(4):1-7.

[2]刘勇,莫笑晗,余清,等.云南、福建、湖南烟区烟草花叶病主要病毒种类检测及黄瓜花叶病毒亚组鉴定[J].植物病理学报, 2006,36(4):310-313.

[3]赵钢.烤烟优良新品种CV 87、CV 85简介[J].上海烟业,1996(2):16-17.

[4]王春军, 陈荣平, 邱恩建,等. 烤烟新品种龙江912 的选育及其特征特性[J].中国烟草科学,2010,31(5):25-28.

[5]申艳霞,范景清,冯国忠,等.烤烟雄性不育一代杂交种辽烟15 号的选育及其特征特性[J].中国烟草,1996(1):6-9.

[6]李永平,卢秀萍,王颖宽.烤烟新品种云烟202的选育及特征特性[J].中国烟草科学,2005,26(4):16-18.

[7]卢秀萍,李永平.烤烟新品种云烟201的选育及其特征特性[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2006,32(4):378-381.

[8]焦芳婵,肖炳光,李永平,等.烤烟新品种“云烟203”的选育及特征特性[J].西南农业学报,2010,23(3):625-628.

[9]杨洪雄,徐兴阳,罗华元,等.云南烟区推广种植NC 102与NC 297品种的良区良法配套方案探索[J].昆明学院学报,2011,33(6):23-26.

[10]Holmes F.O. Inheritance in tobacco of an improved resistance to infection by tobacco mosaic virus[J]. Virology,1960,12(1):59-67.

[11]Chaplin, J.F.,Gooding G.V.. Reaction of diverse Nicotianatabacumgermplasm to tobacco mosaic virus [J].Tob.Sci.1969,13:130-133.

[12]Chaplin, J.F.,Mann T.J..Evaluation of tobacco mosaic resistance factor transferred from burley to flue-cured tobacco[J].J.Hered,1978,69:175-178.

[13]Beekwilder,K.M.The inheritance of resistance to tobacco mosaic virus in tobacco introductions.M.S.thesis.1999,Virginia Polytechnic Inst.and State Univ.,Blacksburg,VA.

[14]Bagley,C.A.Controlling tobacco mosaic virus in tobacco through resistance.M.S.thesis.2002,Virginia Polytechnic Inst.and State Univ.,Blacksburg,VA.

[15]许石剑,肖柄光,李永平.抗TMV育种研究进展[J].中国农学通报,2009,25(16):91-94.

[16]许美玲,赵立红,段玉琪,等.抗TMV烟草种质资源材料的筛选和综合评价[J].植物遗传资源学报,2004,5(2):142-146.

[17]许美玲,赵立红,杨彦明,等.抗主要病害烟草种质资源的筛选[J].种子,2005,24(7):59-61.

[18]刘艳华,王志德,钱玉梅,等.烟草抗病毒种质资源的鉴定与评价[J].中国烟草科学,2007,28(5):1-4.

[19]姜洪甲,邢世东,马维广.抗TMV烤烟种质资源材料筛选与利用研究初报中国烟草科学,2009,30(增刊):53-55.

[20]黄婷,吴云锋,陈伟,等.烟草品种对烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒的抗性鉴定[J].植物病理学报,2013,43(1):50-57.

[21]高玉龙,肖炳光,童治军,等.烟草抗TMV基因连锁分子标记的筛选及在抗病资源筛选中的应用[J].分子植物育种,2011,9(5):585-591.

[22]李梅云,冷晓东,肖炳光,等.烟草抗黑胫病和TMV种质资源的鉴定与评价[J].安徽农业科学,2012,40(23):11 678-11 680.

[23]张玉,罗成刚,殷英,等.烟草N基因及其在烤烟遗传育种中的应用[J].中国农学通报,2013,29(19):89-92.

[24]许美玲.烟草种质库种子清理与重新入库[J].中国农学通报,2006(9):425-428.

[25]中国烟草总公司青州烟草研究所．中华人民共和国国家标准．烟草病害分级及调查方法(GB/T 23222—2008)[S].北京:中国标准出版社,2008

[26]Chaplin,J.F.,Matzinger,D.F.and Mann T.J..Influence of the homozygous and heterozygous mosaic-resistance factor on quantitative character of flue-cured tobacco[J].Tob.Sci.1966,10:81-84.

[27]Legg,P.D.,Collins G.B.,Litton C.C..Effects of the N mosaic resistance factor on agronomic and chemical traits in burley tobacco[J].Crop Sci.1979,19:455-457.

[28]Chaplin,J.F.,Mann T.J.,Apple J.L..Some effects of the Nicotianaglutinosatype of mosaic resistance on agronomic characters of flue-cured tobacco[J].Tob.Sci.1961,5:80-83.

Identification of Tobacco Germplasm with Resistance toTobaccomosaicvirus(TMV)

LIUYong，XUMeiling，HUANGChangjun，LIMeiyun，LIYongping

2016-07-17

中国烟草总公司云南省公司科技项目(编号：2014 YN 02)；中国烟草总公司科技项目(编号：110201401001)。

刘 勇(1970—)，男，湖南益阳人；博士，副研究员，主要从事烟草病害防治与抗病育种研究；E-mail:yliu@yntsti.com。

李永平(1966—)，硕士，研究员，主要从事烟草育种研究；E-mail:liyongping@yntsti.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.12.051

S 432.4+1； S 572

A

1001-4705(2016)12-0051-04