微藻油脂制备生物柴油上游工艺的研究现状及展望

田兴国 杜 伟 刘德华

（清华大学化学工程系，北京 100084）

微藻油脂制备生物柴油上游工艺的研究现状及展望

田兴国 杜 伟 刘德华

（清华大学化学工程系，北京 100084）

田兴国，清华大学化学工程系硕士研究生，主要从事酶促微藻油脂制备生物柴油的研究。

E-mail:thutxgll@163.com

微藻具有生长周期短、含油量高等优点，被认为是一种极具前景的生物柴油大宗原料。微藻的培养、微藻细胞的破碎以及微藻油脂的提取不仅是微藻油脂上游制备阶段的主要工序，也是影响整个生产工艺的成本、效率的重要因素。文章综述了以上3个工序目前在国内外的研究现状，并对各工艺今后的发展方向进行了展望，为进一步提高微藻生物柴油的经济性提出了建议。

能源燃料是科技进步与社会发展的基本驱动力，就目前而言，石化能源（如石油、天然气和煤炭）仍然是人类获取能源的主要途径。近期大量研究表明，全球已探明的常规化石能源储量，最多能维持一至两个世纪人类生存发展的需求，同时化石能源燃烧所产生的二氧化硫、氮氧化物等有毒气体以及可吸入颗粒物等已经对环境造成了严重污染，因此随着生态环境污染的日益加剧和全球石化能源的日渐枯竭，开发一种新的清洁、可再生能源势在必行，这也成为人类摆脱这些困境的重要举措。生物柴油作为一种以生物油脂为原料的生物质能，在微观结构、物理性质等方面都与石化柴油比较接近，甚至具有更好的燃烧性能，因此被认为是一种可以替代石化柴油的可再生能源。

生物柴油的原料广泛，大多数生物体产生的甘油三酯，如各种植物油脂（大豆油、棕榈油等）以及废弃油脂（地沟油、酸化油等）均可用于生物柴油的生产。但大规模生产以植物油脂为原料的生物柴油会产生“与民争油、与粮争地”的问题，且废弃油脂很难保证长期稳定的原料供应，因此其大规模生产受到了多方面的限制。近年来的研究表明，一些微藻可以将其光合产物转化为油脂储存在细胞质中，该油脂与高等植物油相似，都属于甘油三酯，可以加工转化为含硫量、黏度及熔点较低的酯类，如脂肪酸甲酯（C14～C22），即生物柴油。微藻可以有效利用太阳能，将H2O、CO2和无机盐转化为有机资源，具有光合效率高、零净碳值、易培养、生长周期短等优点，且不会影响全球能源分配，因此其产出的油脂被用作生物柴油的新原料在近年来受到了广泛关注。

表1　部分微藻含油量

以甘油三酯为原料制备生物柴油的方法研究已经有很多，其转化工艺已经较为成熟，因此以微藻油脂为原料的生物柴油生产的瓶颈主要在于微藻油脂生产的上游工艺的开发，即微藻油脂的生产及提取工艺。微藻的生产及提取工艺主要分为3个部分，微藻的培养工艺、微藻细胞的破碎以及油脂的提取。本文将结合国内外的研究现状，分别这3个部分进行讨论，并提出今后可能的研发方向。

1　微藻的培养工艺



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目前在国内外已有报道的能源微藻主要是硅藻、绿藻和部分蓝藻，这是因为硅藻和绿藻中碳源主要以油脂的形式储存，经过比较简单的酯交换反应便可以转化为生物柴油，而且有些藻类的油脂含量可以高达其细胞干重的70%以上（表1），有些藻类，如小球藻因易于培养，是比较理想的能源微藻资源，这些藻类都具有极高的应用价值。需要指出的是，不同的藻种，即使是同一藻种因生长环境等因素的不同，其油脂含量也有很大差异，不同培养条件对微藻光合效率和油脂含量都有重要影响。根据微藻自身的营养特点及是否需要外界提供有机物来维持生活将其人工培养工艺分为自养和异养2种方式。

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1.1微藻自养培养

微藻自养培养主要在光生物反应器中进行。光生物反应器是培养微藻的一类装置，其结构与一般的生物反应器相似，是有光、温度、溶解氧和pH等培养条件的调节与控制系统。目前已经报道的光生物反应器有很多种，主要有开放式跑道池和密闭式光生物反应器两类。

开放式跑道池系统为闭合的环形跑道，通常池底较浅以保证较好的透光性，同时采用轮桨使培养液流动，在弯道处有挡板引流，在轮桨前顺着液流投入藻种和营养物，经过循环后在轮桨后收获藻体，这一类培养方法是螺旋藻和小球藻等少数微藻进行商业化生产常用的方法。Moheimani等用跑道池长期半连续培养微藻Pleurochrysis carterae，生物质产率为0.19g（/L·d），含油量为33%。但由于很多微藻不抗杂菌或抵抗杂菌的能力比较弱，开放式跑道池培养系统的发展受到了很大限制。

常见的密闭式光生物反应器有平板式、管式和垂直柱式3种，其中平板式与管式为比较传统的光生物反应器类型。

管式光生物反应器的材料主要有聚乙烯薄膜袋、硬质塑料、透光性好的玻璃、有机玻璃等，除聚乙烯薄膜袋外，其余材料均可通过设计做成不同类型的结构。大多数管式光生物反应器是将主体制成平行排列且彼此相通的管状结构，使藻体接受光照并快速生长，主体上连接有柱形排气装置，用于添加新鲜培养液，并与气泵连接起到换气的作用。这类反应器具有较大的光照面积，可以较低的成本培养得到较高产率的微藻，但管式光生物反应器往往会出现pH梯度以及贴壁生长的现象，在一定程度上降低了培养效果。

与管式光生物反应器相比，板式光生物反应器在结构上具有较大甚至更大的体积、比表面积，有机玻璃、聚乙烯薄膜袋等具有较强的透光性的材料，在板式光生物反应器材料采用上同样受到青睐。同时，板式光生物反应器气液混合高，也可以获得较高的生物质浓度和生物产率，但其在大规模生产中往往需要大量的支撑材料，因此设备的成本是产业化考虑的主要因素，同时这类反应器也存在贴壁生长的现象。

垂直柱式光生物反应器有混合效果好、单位体积气体传递速率高以及培养条件易于控制等优势，克服了前两种反应器存在的贴壁生长问题，是一种比较理想的光生物反应器，其结构为垂直排列且彼此相通的柱状结构，并根据气液混合方式的不同分为鼓泡式和气升式两种。Chiu等用柱式反应器半连续培养微藻Nannochloropsis oculata，鼓泡式通气，生物质产率和脂产率分别达到0.497g（/L·d）和0.151g（/L·d）；张栩等用100L外照人工光源、内导流气升式反应器培养微藻Chlorella sp.，藻产率达0.2134g/（L·d）。与前述的两种光生物反应器相比，垂直柱式光生物反应器的光照面积相对较小，有效地避免了过高的光照强度导致的光抑制和光致氧化现象，但随着微藻培养规模的放大化，其光照面积也会随之更小，严重降低培养效果，因此应选择透光性更好的材料用于反应器的制造。

1.2微藻异养培养

一部分产油微藻可以通过代谢调控使其培养方式由自养转为异养，培养不受光照的影响，生长较快，可以取得更高的产量并缩短培养周期，目前已经发现近百种微藻可以进行异养生长。微藻的异养培养一般是发酵，培养基是在自养培养基的基础上适量添加有机物改进后得到，不同微藻所需的有机物有所差异，其中添加葡萄糖的最多，且能够提高产量，但葡萄糖并不一定是最好的碳源，有研究表明葡萄糖、甘露糖、果糖、蔗糖、半乳糖和乳糖都能不同程度地促进微藻Chlorella zofi ngiensis的藻体生长和虾青素的生物合成。碳源的供给往往在微藻异养培养的成本中占很大的比例，因此为降低发酵的成本，一些廉价的、粗制的碳源被用于微藻的发酵，其中生物柴油的副产品粗甘油被认为是用于替代葡萄糖的一种很好的碳源。Liang等以碱催化制备生物柴油时得到的粗甘油为碳源进行微藻Schizochytrium limacinum SR21的发酵培养，通过对粗甘油pH调节等预处理可以得到与以纯甘油为碳源相近的发酵效果。但粗甘油中通常含有较多的甲醇，因此需对粗甘油的添加量进行控制，避免高浓度甲醇影响藻体的生长。

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微藻能否进行异养最主要的因素是该藻种是否具备完善的吸收、利用胞外有机碳和有机氮的机制。大多数微藻无法进行异养培养主要是以下3个方面机制的缺乏：有机物通透性障碍；相关酶的缺乏；呼吸作用所提供的能量不足以维持其生长。但通过在异养培养条件下对微藻进行筛选或利用生物工程的手段对微藻进行异养化改造可以获得能够异养化的藻种，然后通过对发酵条件的优化即可以实现异养微藻大规模的生产。

与自养相比，异养生长速率快、无需光照、产量高、培养周期短，但异养培养微藻来生产生物柴油能耗高、生产成本高，而且还会增加CO2的排放，因此目前异养培养主要是用于生产高附加值脂肪酸。

2　微藻细胞的破碎

将产油微藻进行大规模培养后需要提取微藻细胞内储存的油脂，但由于大部分微藻细胞都存在细胞壁，因此在提取前常常需要对细胞进行破碎处理，以加快油脂的释放，这是影响上游工艺的效率和成本的重要因素。传统的微藻细胞破碎方法主要分为机械破碎法和非机械破碎法。

2.1机械破碎法

机械破碎法主要是通过机械外力的作用破坏细胞壁的完整结构，从而使细胞破碎，胞内物质进入外部环境。常见的机械破碎法包括高压匀浆破碎法、超声破碎法及球磨法等。

高压匀浆破碎法是大规模破碎细胞的常用方法，破碎过程在高压匀浆器中进行。首先应用高压使细胞悬浮液通过针型阀，利用突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针型阀喷出时每秒速度可达几百米，高速喷出的浆液打到撞击环上被迫改变方向从出口管流出，在这一过程细胞经历了剪切、撞击以及由高压到低压的变化，从而使细胞破碎。Samarasinghe等研究了高压匀浆法在不同的条件下对微藻N. oculata的破碎效果，发现喷嘴两端的压力差以及破碎的次数是影响其破碎结果最主要的因素，且在4×1 04p s i（1psi=6894.76Pa）压力和100μm的针型阀孔径条件下，经过6次破碎，细胞只有约1%未被破碎。高压匀浆法适用范围广、效率高，但在高压条件下经过多次匀浆破碎后会导致体系严重乳化，提高了后续分离工艺的难度。

目前用于细胞破碎的超声波仪器主要有超声波振荡器以及超声波粉碎机等，其优点是省时、损失样品量少，可用于处理大量的样品。王雪青等研究了超声破碎对17种微藻液的处理效果，发现经过12min的超声处理后，17种微藻液均能够达到90%以上的破碎效果，且不同的藻种对超声的敏感性不同，如牟氏角毛藻、甲藻超声处理仅需0.7min，细胞破碎率就达到95%，而对于小球藻、衣藻和杆状藻，细胞处理时间需要12min以上才能达到90%以上的破碎率，这表明不同藻种自身的结构特性决定了其对超声的敏感性。由于超声破碎法的不断发展以及改进，目前在生物生产中是最为常用的破碎方法之一，但处理过程的成本较高，同时易引起温度剧烈上升导致声能传递和散热困难，产生的化学自由基团易使产物失活，也影响了其在大规模工业生产上的应用。

球磨法是一种比较有效的细胞物理破碎法，其主要利用固体间研磨剪切力和撞击使细胞破碎。球磨机的主体一般是立式或卧式的圆筒形腔体，在磨腔中装有钢珠或者小玻璃珠以提高研磨能力。陈伟平等模拟球磨机的工作原理研究了球磨法对紫球藻、蔷薇藻和念珠藻3种微藻藻液的处理效果，发现加入玻璃珠后处理的效果比没有加入玻璃珠处理并没有明显的提升。因此虽然球磨法的处理成本较低，但其有效利用率很低，同时破碎过程会产生大量的热能，还需考虑换热问题，相比而言使用球磨法进行微藻细胞破碎并不是十分理想。

采用机械破碎法破碎微藻细胞一般不会向体系中引入其他的杂质，但大多数处理方法的油脂得率相对较低且不具有普遍适用性，而破碎效果稍好的超声破碎法的成本又比较高，因此目前对非机械破碎法破碎微藻细胞的研究较多。

2.2非机械破碎法

非机械破碎法指所有不通过机械外力的作用来破坏细胞壁及细胞膜完整结构的细胞破碎方法，这种方法主要有两种途径，一种是向藻液中加入化学试剂或者生物酶，从而增大细胞膜的通透性使胞内产物容易释放到外环境中，或者与细胞壁发生反应将细胞壁溶解使胞内产物释放；另一种途径是通过调节外部环境的渗透压等条件使得细胞发生膨胀，最终导致细胞破裂，胞内物质释放，通过这一类途径实现微藻细胞破碎的方法有反复冻融法、渗透压冲击法。

微藻细胞壁的结构骨架多由纤维素组成，以微纤丝的方式层状排列，因此有应用纤维素酶处理微藻细胞，使得细胞壁溶解然后进一步提取的研究；微藻细胞中通常还含有一些多糖，因此也有利用纤维素酶与糖化酶等多种酶一起处理微藻细胞的研究。何扩等在小球藻破壁技术的研究中经过对工艺的优化，发现在纤维素酶单独作用时最佳酶量为2%，若采用复合酶作用时其最佳酶量为1%，但使用纤维素酶单独作用处理效果更好。Choi等采取分步加酶进行细胞裂解，避免了不同酶同时加入产生的相互作用，最终得出优化工艺为液化阶段添加0.005%的α-淀粉酶，90℃反应30min，糖化阶段添加0.2%糖化酶，在55℃、pH4.5的条件下反应30min，得到了理想的结果。

用化学法及酶法进行细胞破碎会向体系内引入其他杂质，在后续工艺中需要进一步分离，相比而言，通过细胞膨胀破碎细胞不会向体系中引入其他杂质，其中利用反复冻融法破碎微藻细胞的研究较多。反复冻融法是将紫球藻置于低温环境中，使细胞内外环境中的绝大多数水形成冰晶，冰晶的形成产生了膨胀压，导致细胞产生机械损伤，同时未发生冻结的胞内残存液由于在冻结过程中冰晶的析出使溶质浓缩、渗透压改变等，而溶解又会使细胞发生溶胀，最终使细胞破碎和死亡。王雪青等采用反复冻融法对17种微藻2次冻融，细胞破碎率在30%～90%，其中10种微藻的破碎率在95%以上，4种微藻在60%～80%，而紫球藻、小球藻和扁藻的细胞破碎率小于40%，因此需增加反复冻融的次数或者采用超声波等其他辅助方法。Soni等采用反复冻融法提取Oscillatoria quadripunctulata藻胆蛋白，经过4次冻融可以提取出胞内大部分藻胆蛋白。

另一种通过细胞膨胀使其破碎的方法为渗透压冲击法，即先将细胞置于高渗溶液中，细胞发生收缩，然后将介质快速稀释或将细胞转入水（或缓冲液）中，细胞快速膨胀以致破裂，从而使产物释放到溶液中。Byreddy等研究发现在Schizochytrium sp. S31和Thraustochytrium sp. AMCQS5-5的细胞破碎中，相比于球磨法等机械破碎方法，渗透压冲击法的油脂得率是其他方法的两倍，分别为48.7%和29.1%。相比于机械方法，渗透压冲击法耗能低得多，且易于扩大化，但弊端在于破碎耗时较长，废弃盐水处理困难。

通过机械破碎法与非机械破碎法实现微藻细胞的破碎各有利弊。机械破碎法与反复冻融法不会向体系中引入其他杂质，但其细胞破碎率往往较低，不能达到完全破碎的效果；采用化学法与酶法破坏微藻细胞的细胞壁通常会有较高的破碎率，但会向体系中引入其他杂质，需要在后续工艺中进一步分离。同时，由于各种藻类细胞壁物理性质及化学组成的差异，不同的藻种需采用不同的破碎工艺。

3　微藻油脂的提取

除微藻的培养与破碎外，对微藻细胞内或破碎细胞壁后的藻液中油脂组分的提取也是微藻油脂制备生物柴油工艺中重要的环节，油脂提取的效果会显著影响微藻油脂在后续的转化工艺中的转化效果，且不同的提取技术也会影响整个生产链的成本。目前研究较多的微藻油脂提取方法主要是有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法和原位油脂萃取法。

3.1有机溶剂萃取法

有机溶剂萃取法主要是利用油脂能够溶于某些溶剂的特性，通过浸湿渗透、分子扩散等将菌体细胞中的油脂提取出来，较为常用的有机溶剂是苯、丙酮、己烷、环己烷、乙醚等，这些溶剂对微藻油脂的提取效果较好，可以用单一或几种溶剂混合物作为提取剂。目前Bligh和Dyer于1959年提出的甲醇/氯仿体系仍为最常用的微藻油脂提取方法。该方法基于“相似相溶”原理，当藻体与甲醇/氯仿混合溶剂充分接触时，甲醇作为极性溶剂与微藻细胞膜的极性脂结合，从而破坏脂质与蛋白质分子之间的氢键和静电作用，使得溶剂氯仿进入细胞并溶解胞内疏水的中性脂成分，在充分萃取后向体系中加入水，甲醇即可溶于水，与含油脂的氯仿相分层，将氯仿挥发后即可得到粗脂提取物，但因氯仿对人体有较大毒性，类似的低毒双溶剂体系萃取法也有较多研究，如正己烷/异丙醇、正己烷/乙醇等。另外也有研究通过索氏提取法进行微藻油脂的萃取，即利用有机溶剂在索氏提取器中的回流和虹吸，使微生物油脂不断被萃取，这种方法相应的油脂得率较高，但耗时长，需要加热消耗能量大，因此在工业生产中采用该方法的成本较高。刘宪夫等研究不同提取方法对小球藻油脂得率的影响，结果发现索氏提取法中以无水乙醇作为溶剂进行索氏提取得到的提取率（24.37%±0.21%）比氯仿/甲醇体系浸提（22.40%±0.89%）还要略高一点，但无水乙醇提取出的油脂中长链脂肪酸（C14～C22）比例不及氯仿/甲醇体系得到的油脂，相比而言氯仿/甲醇体系得到的油脂更适于生物柴油的生产。

3.2超临界流体萃取法

超临界流体萃取是一种新兴的油脂提取技术，其原理是当流体的温度和压力超过其临界值时，状态介于气态和液态之间，该状态下流体同时具有气体的扩散传质性能和液体的溶解性能，因此对微藻油脂的提取效率要远高于普通的有机溶剂。这种方法可以避免产物发生氧化，不会破坏提取物，速度快，安全无污染，但需要专门的仪器设备，操作成本也较高。Couto等研究了在323K 、30MPa的条件下，用超临界CO2萃取Crypthecodinium cohnii细胞质内油脂3h，油脂得率为14.6%，相比于Bligh-Dyer提取方法，超临界CO2萃取法具有更高的选择性，在该研究中几乎50%的C22:6（DHA）可以被提取出来，且浓度可达到总脂肪酸的72%。应用此方法萃取出的油脂，在回收时只需通过控制温度与压力使CO2恢复气态即可分离得到油脂，不会引入其他物质，但这种方法能耗大、经济性较差，不适合大宗化学品的提取，由于其较高的选择性，通常可以用于一些功能性油脂的提取。

图1　原位萃取流程

3.3原位油脂萃取法

由于微藻培养得到的油脂浓度不高，因此对微藻依次进行采收、破碎以及油脂提取的总能耗比较大，这也是微藻生物柴油工业化的瓶颈之一。有研究从系统工程的角度出发，将微藻采收与油脂提取进行了过程集成，提出了原位油脂萃取的新型油脂提取工艺，其流程如图1所示。原位萃取是指建立生物相容性有机溶剂与藻液共混的两相体系，使目标产物不断萃取至溶剂相，同时藻细胞仍在不断合成产物的模式，使微藻采收与产物提取过程集成从而实现了一个连续的过程。该法与传统的方法相比，优势在于：①可以在常温常压下操作；②培养与提取同步进行，无需藻体干燥；③解除产物抑制，提高油脂产量。张芳等以Botryococcus braunii为出发藻种，以十四烷为有机溶剂进行原位油脂萃取，并引入有机材料的中空纤维膜作为介质，提高溶剂在藻液中的分散效率，有效地增加了藻体与有机溶剂的接触面积，经过96h的连续处理后，油脂的萃取率为50.15%，细胞存活率为92%，可见该方法不仅有较高的优质萃取效率，还能在萃取过程中较好地保持藻细胞活性，使其继续合成油脂。虽然该方法的处理规模目前还在实验室阶段，但该方法具有理想的处理效果，同时也说明对整个微藻油脂提取工艺进行集成优化是降低成本、提高效率的有效途径。

原位萃取从整个工艺上降低了能耗，为下游工艺减轻了负荷，并可以有效解除培养过程中出现的产物抑制。但只有当微藻可将产物及时排到胞外便于萃取时，才可将微藻培养与油脂萃取耦合起来，若所培养的微藻需要破碎后才能进行油脂萃取时，油脂原位萃取则无法进行，因此筛选并培养出适宜的藻种是解决这一问题的有效途径。

4　展 望

能源问题已成为人类长期关注的问题，随着微藻油脂研发技术的日益成熟化，以微藻油脂为原料制备生物柴油的新途径将具有广阔的应用前景。目前该途径尚未实现工业化生产，其主要瓶颈在于减少微藻油脂上游制备阶段的成本，因此寻找廉价、高效、可规模化的油脂制备工艺将可以大大促进微藻油脂制备生物柴油的产业化。降低工艺成本主要可以从上游制备技术的3个部分进行探索：①微藻培养技术主要应从自养培养型出发，通过对生物反应器的优化设计提高培养过程中的光能利用率、传质速率等，从而提高微藻油脂的产出速率；②微藻的破碎是上游工艺中耗能最高的，但由于微藻破碎不完全会直接导致原料大量的浪费，应当考虑在尽可能高破碎率的前提下降低处理的工艺，如使用酸热法工艺并在后续油脂纯化工艺中将多种杂质分离工艺耦合等；③油脂提取阶段传统的双溶剂体系萃取法仍为主流的处理方法，效果也比较理想，可以借用原位油脂萃取法中提出的过程集成的思路，将上游的多个工艺集成实现连续性的生产是降低成本的有效途径。

10.3969/j.issn.1674-0319.2016.02.004