肉鸡肥胖基因WDTC1组织表达特性及油脂类型和水平对WDTC1基因表达的影响

王 婷 陶亚飞 陈 青 陈 文 黄艳群*

(1.河南农业大学牧医工程学院，郑州450002；2.河南农业大学国家家养动物种质资源平台，郑州450002)



肉鸡肥胖基因WDTC1组织表达特性及油脂类型和水平对WDTC1基因表达的影响

王 婷1,2陶亚飞1,2陈 青1,2陈 文1黄艳群1,2*

(1.河南农业大学牧医工程学院，郑州450002；2.河南农业大学国家家养动物种质资源平台，郑州450002)

肉鸡肥胖基因WDTC1 (WD and tetratricopeptide repeats 1) 是小鼠adipose基因的同源基因，是调控能量代谢、脂肪沉积和血清甘油三酯水平的关键基因。本试验旨在分析肉鸡WDTC1基因组织表达谱及不同类型和水平的油脂对肉鸡不同组织、不同日龄WDTC1基因表达的影响。随机挑选42日龄商品肉鸡母雏5只，进行WDTC1基因的组织表达谱分析。在此基础上，试验选取240只1日龄科宝肉鸡母雏，随机分为8个组(分别在饲粮中添加2.50%、5.00%的亚麻油、玉米油、芝麻油和猪油)，每组6个重复，每个重复5只鸡，分别于21和42日龄时从每个重复随机选取1只肉鸡屠宰取样，通过三因素析因试验设计分析油脂类型、水平和肉鸡组织以及油脂类型、水平和肉鸡日龄对肉鸡WDTC1基因表达的交互效应。结果表明：1)WDTC1基因在肉鸡各个组织中广泛表达，其中在卵巢组织中表达量最高，其次是肝脏、肾脏、脑、肺脏、胸肌、心脏、小肠等组织，在胰腺组织中表达量最低。2)油脂类型对42日龄肉鸡不同组织中WDTC1基因相对表达量的影响极显著(P<0.01)，且油脂类型与肉鸡组织(P<0.01)、油脂类型与油脂水平(P<0.05)的交互效应显著；2.50%和5.00%油脂水平时亚麻油组42日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量显著高于腹脂组织(P<0.05)，且亚麻油组肝脏组织中WDTC1基因的相对表达量显著高于芝麻油组(P<0.05)；2.50%油脂水平时芝麻油组肉鸡腹脂组织中WDTC1基因相对表达量却显著高于亚麻油组(P<0.05)；油脂类型和水平对42日龄肉鸡胸肌组织中WDTC1基因相对表达量的影响无显著差异(P>0.05)。3)油脂类型对不同日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量的影响极显著(P<0.01)，且油脂类型与油脂水平的交互效应显著(P<0.05)；2.50%和5.00%油脂水平时猪油组21日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量显著高于42日龄时(P<0.05)；2.50%油脂水平时亚麻油组肝脏组织中WDTC1基因相对表达量显著高于猪油组(P<0.05)，5.00%油脂水平时亚麻油和玉米油组42日龄肉鸡肝脏组织WDTC1基因相对表达量显著高于芝麻油组(P<0.05)。由此可见，肉鸡WDTC1基因的表达有时空特异性，优势表达组织为肝脏，WDTC1基因表达量受油脂类型、肉鸡组织、肉鸡日龄、油脂类型与油脂水平以及油脂类型与肉鸡组织的交互影响。

肉鸡；油脂；WDTC1；基因表达

Adipose基因，最初在果蝇中被克隆鉴定为肥胖相关基因并命名为adp[1-3]，在哺乳类动物中adipose基因的同源基因被命名为WDTC1 (WD and tetratricopeptide repeats 1)基因，该基因从果蝇到人类的保守性均很高[4]。WDTC1蛋白包含WD40重复和肽重复序列结构域，它们对WDTC1蛋白与组蛋白的结合有重要作用[5-6]。WDTC1蛋白通过与组蛋白2B(H2B)、组蛋白4(H4)和组蛋白去乙酰化酶3形成染色质重组复合体，抑制过氧化物增殖激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的转录活性，进而抑制脂肪生成、减少脂肪积累[4,5,7-10]。WDTC1蛋白以剂量依赖方式抑制脂肪的积累，当WDTC1基因过表达时，果蝇体内的脂肪沉积减少、血清甘油三酯水平降低；WDTC1基因缺乏时，个体表现为肥胖[4]。Suh等[10]发现遗传型和饲粮诱导肥胖鼠较野生型小鼠和饥饿小鼠脂肪细胞中WDTC1蛋白水平均有所下降，这表明WDTC1蛋白可能参与调控哺乳动物的脂肪发生。在人类的研究中也发现WDTC1基因的变异与肥胖有关，单不饱和脂肪酸摄入量不同对不同WDTC1基因型个体的身体质量指数具有不同的效应[11]。Wu等[12]发现了猪WDTC1基因5′侧翼区有与脂肪细胞分化及炎症相关的关键转录因子的潜在结合位点，提示WDTC1蛋白在能量代谢上有重要作用。目前有关WDTC1基因在畜禽上的研究较少，比较基因组学的分析表明WDTC1基因也是影响鸡脂肪沉积的潜在候选基因，但至今尚未见有关鸡WDTC1基因的系统报道。

玉米油[13]和芝麻油是n-6脂肪酸的代表，含有较高的亚油酸和油酸[14-15]；亚麻籽油是n-3脂肪酸的代表，其n-6/n-3多不饱和脂肪酸的比值(约为0.34∶1.00)远远低于其他油脂[16-17]；猪油是富含单不饱和脂肪酸的动物油，其油酸含量高达48.7%[18]。WDTC1基因在动物体脂肪沉积及能量代谢中可能具有重要作用，饲粮油脂可能对其表达调控有重要影响。本试验在分析肉鸡WDTC1基因组织表达谱的基础上，进一步研究油脂类型和水平对其表达调控的影响，旨在深入了解鸡WDTC1基因的表达特性。

1 材料与方法

1.1 试验设计

随机挑选5只42日龄商品肉鸡母雏，以用于鸡WDTC1基因的组织表达谱分析。在此基础上，采用具有重复观测值的三因素析因试验设计，探究油脂类型、水平和肉鸡组织以及油脂类型、水平和肉鸡日龄对肉鸡WDTC1基因表达的交互效应。该研究选用240只1日龄科宝肉鸡母雏，随机分为8个组，每组6个重复，每个重复5只鸡。试验鸡采用笼养，每笼5只鸡，自由采食和饮水。免疫程序按常规进行。饲粮参照NRC(1994)肉鸡营养需要配制，分为1～3和4～6周龄2个阶段饲养。1～4组饲粮分别添加2.50%的亚麻油、玉米油、芝麻油和猪油；5～8组饲粮分别添加5.00%的亚麻油、玉米油、芝麻油和猪油。饲粮组成及营养水平同张雯雯[19]文献中“表1”和“表2”。

1.2 样品采集

在无菌操作条件下采集各商品肉鸡母雏的腹脂、皮下脂肪、皮肤、脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、胸肌、腿肌、肌胃、小肠、胰腺组织以用于WDTC1基因的组织表达谱分析。在饲粮油脂类型和水平对肉鸡WDTC1基因表达效应的研究中，分别于21日龄和42日龄时从每个重复随机挑选1只肉鸡屠宰，无菌操作条件下收集21日龄鸡只的肝脏组织以及42日龄鸡只的腹脂、肝脏和胸肌组织。所取组织样品均用焦碳酸二乙酯(DEPC)水清洗后，液氮中速冻，-80 ℃保存备用。

1.3 总RNA提取和反转录反应

1.4 引物设计

根据红色原鸡的WDTC1基因序列(GenBank登录号：XM_417728.4)，用Oligo 6.0软件设计荧光定量PCR所用的检测引物，并由上海生物工程技术服务有限公司合成。正、反向引物及探针如表1。

表1 PCR引物

F：上游 forward；R：下游 reserve；P：探针 probe。

1.5 荧光定量PCR反应条件

参照Li等[20]文献，运用探针法荧光定量PCR(qPCR)进行基因的定量表达分析。反应体系为25.0 μL，包括1.0 μL cDNA(0.1 μL总RNA)、0.5 μL上游引物(12.5 μmol/L)、0.5 μL下游引物(12.5 μmol/L)、2.5 μL TaqManTM探针、0.5 μL RoxⅡ、3.5 μL镁离子(Mg2+，25 mmol/L)、12.5 μL 2×Mix(包含1.5 mmol/L Mg2+)、4.0 μL超纯水；荧光定量PCR反应条件为95 ℃预变性2 min；40个循环的95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min。每个样品设置3个重复。纯化的PCR产物采用微量分光光度计(NanoDrop 2 000 UV spectrophotometer)测定浓度后，进行梯度(104、105、106、107、108、109和1010)稀释，用于建立每板的标准曲线。每板均设阴性对照。参照Bustin[21]报道，本研究采用微量定量仪测定RNA的浓度，反应中添加等量的RNA和cDNA进行每个样品的均一化处理，研究已证明该方法是进行基因表达的定量研究中最可靠的均一化方法。组织表达图谱中WDTC1基因的组织相对表达量=样本拷贝数/胰腺拷贝数平均值。油脂添加组中WDTC1基因的相对表达量=样本拷贝数/腹脂平均拷贝数最小组均值(2.50%油脂水平时玉米油组均值)。

1.6 数据统计和分析

用SPSS 17.0软件的独立样本t检验方法分析鸡WDTC1基因的组织表达谱；用单变量三因素方差完全交互分析方法分析油脂类型、水平和肉鸡组织以及油脂类型、水平和肉鸡日龄三因素交互作用对WDTC1基因表达量的效应，结果以平均值(mean)表示。P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 鸡WDTC1基因组织表达谱分析

运用qPCR对鸡WDTC1基因在15个不同组织中的表达情况进行了分析，结果见图1。鸡WDTC1基因在所有检测组织中均有表达，其中在胰腺组织中表达量最低，在卵巢组织中表达量最高，为胰腺中表达量的16.7倍，其次是肝脏、肾脏、脑、肺脏、胸肌、心脏、小肠等组织。除腹脂、皮下脂肪外，其余组织中WDTC1基因的表达量均显著高于胰腺中的表达量(P<0.05)。

2.2 油脂类型和水平对42日龄肉鸡不同组织中WDTC1基因相对表达量的影响

油脂类型和水平对42日龄肉鸡不同组织WDTC1基因相对表达量的影响见表2。油脂类型对42日龄肉鸡不同组织中WDTC1基因相对表达量的影响极显著(P<0.01)，且油脂类型与肉鸡组织(P<0.01)、油脂类型与油脂水平(P<0.05)的交互效应显著。

与组织表达谱结果一致，42日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量高于胸肌和腹脂组织。5.00%油脂水平时亚麻油、玉米油和猪油组42日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量均显著高于腹脂组织(P<0.05)；2.50%油脂水平时亚麻油组42日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量显著高于腹脂组织(P<0.05)；2.50%和5.00%油脂水平时芝麻油组42日龄肉鸡肝脏、腿肌和腹脂组织间WDTC1基因的相对表达量无显著差异(P>0.05)。

1：腹脂 abdominal fat；2：皮下脂肪 subcutaneous fat；3：皮肤 skin；4：脑 brain；5：心脏 heart；6：肝脏 liver；7：脾脏 spleen；8：肺脏 lung；9：肾脏 kidney；10：卵巢 ovary；11：胸肌 breast muscle；12：腿肌 leg muscle；13：肌胃 muscular stomach；14：小肠 small intestine；15：胰腺 pancreas。

数据柱标注**表示该组织中表达量极显著高于胰腺组织中表达量(P<0.01)，标注*表示该组织中表达量显著高于胰腺组织中表达量(P<0.05)，NS表示该组织中表达量与胰腺组织中表达量差异不显著(P>0.05)。

Data column with ** mean expression in tissue extremely significantly higher than that in pancreas (P<0.01), and with * mean expression in tissue significantly higher than that in pancreas (P<0.05), while with NS mean no significant difference between expression in this tissue and that in pancreas (P>0.05).

图1 肉鸡WDTC1基因的组织表达谱

Fig.1 Tissue expression profile ofWDTC1 gene in broilers

42日龄肉鸡肝脏组织中，2.50%和5.00%油脂水平时亚麻油组WDTC1基因相对表达量均最高，2.50%油脂水平时亚麻油组WDTC1基因相对表达量显著高于其他油脂组(P<0.05)，5.00%油脂水平时亚麻油组WDTC1基因相对表达量显著高于芝麻油组(P<0.05)；42日龄肉鸡腹脂组织中，2.50%油脂水平时芝麻油和猪油组WDTC1基因的相对表达量显著高于亚麻油组和玉米油组(P<0.05)，而5.00%油脂水平时各油脂组间WDTC1基因的相对表达量无显著差异(P>0.05)。油脂类型和水平对肉鸡胸肌组织中WDTC1基因的相对表达量无显著影响(P>0.05)；

表2 油脂类型和水平对42日龄肉鸡不同组织中WDTC1基因相对表达量的交互效应

续表2项目Items油脂类型Oiltype油脂水平Oillevel/%肝脏Liver胸肌Breastmuscle腹脂Abdominalfat显著性Significance油脂类型Oiltype## 亚麻油>玉米油≥猪油>芝麻油油脂水平OillevelNS肉鸡组织Tissueofbroilers## 肝脏>胸肌>腹脂油脂类型×油脂水平Oiltype×oillevel#油脂类型×肉鸡组织Oiltype×tissueofbroilers##油脂水平×肉鸡组织Oillevel×tissueofbroilersNS油脂类型×油脂水平×肉鸡组织Oiltype×oillevel×tissueofbroilersNS

同列数据同一油脂水平肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。同行数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)。##表示差异极显著(P<0.01)，#表示差异显著(P<0.05)，NS表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

Values in the same column of the same oil level with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). Values in the same row with different large letter superscripts mean significant difference (P<0.05). ## mean extremely significant difference (P<0.01), and # mean significant difference (P<0.05), while NS mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3 油脂类型和水平对不同日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量的影响

油脂类型和水平对不同日龄肉鸡肝脏组织WDTC1基因相对表达量的影响见表3。油脂类型对不同日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量的影响极显著(P<0.01)，且油脂类型与油脂水平的交互效应显著(P<0.05)。

各油脂水平时各油脂组21日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量均高于42日龄时。2.50%油脂水平时玉米油、芝麻油和猪油组21日龄肉鸡肝脏组织中WDTC1基因相对表达量极显著高于42日龄时(P<0.01)；5.00%油脂水平时猪油组肉鸡21日龄猪肝脏WDTC1基因相对表达量显著高于42日龄时(P<0.05)；各油脂水平时亚麻油组21日龄和42日龄肉鸡WDTC1基因相对表达量无显著差异(P>0.05)。

21日龄时，2.50%油脂水平时猪油组肉鸡肝脏组织WDTC1基因相对表达量最低，显著低于亚麻油组(P<0.05)，而5.00%油脂水平时各油脂组肝脏组织WDTC1基因相对表达量无显著差异(P>0.05)；42日龄时，2.50%油脂水平时亚麻油组肝脏组织WDTC1基因相对表达量显著高于其他油脂组(P<0.05)；5.00%油脂水平时亚麻油和玉米油组肝脏组织WDTC1基因相对表达量显著高于芝麻油组(P<0.05)。

3 讨 论

组织表达谱分析是有效研究基因功能的基础工作，为进一步了解基因的表达提供有用的参考信息[22]。与果蝇[4]、鼠[10]和猪[12]上的研究结果一致，WDTC1基因在肉鸡组织中广泛表达，在生殖器官(卵巢)中的表达量远高于其他组织。WDTC1基因在不同物种间的表达也有所不同，猪WDTC1基因在肾脏、肺脏和脂肪组织中表达量高，在骨骼肌组织中的表达量相对较低[12]，而鸡WDTC1基因在肝脏、胸肌、腿肌组织中大量表达，在腹脂组织中的表达量较低，提示WDTC1基因在不同物种间功能的差异性。

肝脏组织中WDTC1基因的表达呈现出随日龄的增长而下降的趋势，提示了鸡WDTC1基因表达的时空特异性。亚麻油组肉鸡WDTC1基因呈现出在不同油脂水平、不同日龄时在肝脏组织中的相对高水平稳定表达，提示亚麻酸以非剂量依赖的方式保持WDTC1基因在组织中的稳定表达，延缓肝脏WDTC1基因的表达随日龄的增长而降低的趋势。

研究表明，长链脂肪酸可以调控脂代谢相关基因的表达[23-24]。陈行杰[25]研究发现，饲粮中添加鱼油降低了猪脂肪组织中肥胖基因(ob)和瘦素(leptin)的长型受体基因的表达水平，而豆油提高了脂肪组织中PPARγ基因的表达水平，并提高了背部脂肪和腹部脂肪组织中类胰岛素生长因子(insulin-like grouth factors-1，IGF-1)基因的表达水平，降低了内脏脂肪组织中IGF-1基因的表达水平。本试验中肝脏组织中WDTC1基因的表达量高于腹脂组织，肝脏是肉鸡WDTC1基因的优势表达组织，这可能与鸟类肝脏的脂肪生成能力显著高于脂肪组织，是脂肪合成的主要场所有关[26-30]。2.50%油脂水平时亚麻油上调了42日龄肉鸡肝脏组织WDTC1基因的表达量而下调了腹脂组织WDTC1基因的表达量，芝麻油则下调了肝脏组织WDTC1基因的表达量而上调了腹脂组织WDTC1的表达量，提示油脂类型以组织特异性的方式影响42日龄肉鸡WDTC1基因的表达。n-3脂肪酸(亚麻油)提高肝脏组织WDTC1基因的表达量，而n-6脂肪酸(芝麻油)提高脂肪组织WDTC1基因的表达量，这可能与芝麻油含有较多的固醇、芝麻酚、芝麻酚林和芝麻素等不皂化物，具有抗氧化性和独特的生理作用有关[14]。

表3 油脂类型和水平对不同日龄肉鸡肝脏中WDTC1基因相对表达量的交互影响

本试验发现，随着油脂水平的提高，油脂类型对42日龄肉鸡腹脂组织WDTC1基因表达量影响的差异进一步减小；在21日龄和42日龄肉鸡肝脏组织中也呈现出类似的现象，随油脂水平的提高，WDTC1基因的表达量在不同油脂类型间的差异减小，提示油脂类型以油脂剂量依赖的方式影响WDTC1基因的表达。

4 结 论

肉鸡WDTC1基因的表达有时空特异性，其优势表达组织为肝脏，在肝脏中的表达量高于在腹脂中的表达量，肉鸡肝脏组织中WDTC1基因的表达量随着肉鸡日龄的增长而降低。油脂类型影响WDTC1基因的表达量并呈现出与油脂水平、肉鸡组织的交互效应，亚麻油可使肉鸡肝脏组织中WDTC1基因的表达量在不同油脂水平和肉鸡日龄均维持较高的水平。油脂类型和水平对42日龄肉鸡胸肌组织中WDTC1的表达量无显著影响。

致谢：

感谢河南农业大学牧医工程学院王志祥教授对该文稿所提出的宝贵意见。

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*Corresponding author, professor, E-mail: hyanqun@aliyun.com

(责任编辑 李慧英)

Tissue Expression Characteristics of Obesity GeneWDTC1 of Broilers and Effects of Oil Type and Level onWDTC1 Gene Expression

WANG Ting1,2TAO Yafei1,2CHEN Qing1,2CHEN Wen1HUANG Yanqun1,2*

(1. Animal Husbandry Medical College of Engineering, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Henan Agricultural University National Germplasm Resources Platform for Animals, Zhengzhou 450002, China)

Broiler obesity geneWDTC1 (WD and tetratricopeptide repeats 1), a homologous gene of mouseadiposegene, has become a key gene in regulating energy metabolism, fat deposition and serum triglyceride level. This experiment was conducted to analyze the tissue expression profile ofWDTC1 gene in broilers and the effects of different types and different levels of oil onWDTC1 gene expression of broilers in different tissues and at different days of age. Five commercial female broilers at 42 days of age were randomly selected to analysis the tissue expression profile ofWDTC1 gene in broilers. On this basis, two hundred and forty 1-day-old Cobb female broilers were randomly assigned to 8 groups (fed basal diets added with 2.50% and 5.00% linseed oil, corn oil, sesame oil and lard oil, respectively) with 6 replicates per group and 5 broilers per replicate. One broiler of each replicate was selected to slaughter at age of 21 days and 42 days, respectively. The interactive effects of oil type, oil level and tissue of broilers and oil type, oil level and days of age of broilers onWDTC1 gene of broilers were designed to analysis by three factors factorial experiment design. The results showed as follows: 1)WDTC1 gene was found to be widely expressed in various tissues of broilers, and the expression level was the highest in the ovary, then in liver, kidney, brain, lung, breast muscle, heart and small intestine, and the expression level was the lowest in pancreas. 2) The relative expression level ofWDTC1 gene in different tissues of broilers at 42 days of age was significantly affected by the oil type (P<0.01), and the interactive effects of oil type and tissue of broilers (P<0.01) and oil type and oil level (P<0.05) also had significant effects on the relative expression level ofWDTC1 gene. The relative expression level ofWDTC1 gene in liver of broilers at 42 days of age in linseed oil group at 2.50% and 5.00% oil levels was significantly higher than that in abdominal fat (P<0.05), and the relative expression level ofWDTC1 gene in liver in linseed oil group was significantly higher than that in sesame oil group (P<0.05). The relative expression level ofWDTC1 gene in abdominal fat of broilers in sesame oil group at 2.50% oil level was significantly higher than that in linseed oil group (P<0.05). Oil type and level had no significant effect on the relative expression level ofWDTC1 gene in breast muscle of broilers at 42 days of age (P>0.05). 3) The relative expression level ofWDTC1 gene in liver of broilers at different days of age was significantly affected by the oil type (P<0.01), and the interactive effect of oil type and oil level also had significant effect on the relative expression level ofWDTC1 gene (P<0.05). The relative expression level ofWDTC1 gene in liver of broilers at 21 days of age in lard oil group at 2.50% and 5.00% oil levels was significantly higher than that at 42 days of age (P<0.05). The relative expression level ofWDTC1 gene in liver in linseed oil group at 2.50% oil level was significantly higher than that in lard oil (P<0.05), and the relative expression level ofWDTC1 gene in liver of broilers at 42 days of age in linseed oil and corn oil groups at 5.00% oil level was significantly higher than that in linseed oil group (P<0.05). In conclusion,WDTC1 gene expression of broilers has the temporal and spatial specificities, and liver is the predominantly expression tissue.WDTC1 expression level is affected by oil type, tissue of broilers, days of age of broilers and the interaction effects of oil type and oil level, oil type and tissue of broilers.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(11)：3511-3519]

broilers; oil;WDTC1; gene expression

2016-04-25

国家自然科学基金(31272434)

王 婷(1992—)，女，河南周口人，硕士研究生，动物遗传育种与繁殖专业。E-mail: wangting917@163.com

*通信作者：黄艳群，教授，硕士生导师，E-mail: hyanqun@aliyun.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.11.018

S831.5；S816.4

A

1006-267X(2016)11-3511-09