不同溶解氧间歇曝气对亚硝酸盐氧化菌的影响

包 鹏，王淑莹，马 斌，张 琼，彭永臻 （北京工业大学，北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京污水脱氮除磷处理与过程控制工程技术研究中心，北京 100124）

不同溶解氧间歇曝气对亚硝酸盐氧化菌的影响

包 鹏，王淑莹*，马 斌，张 琼，彭永臻 （北京工业大学，北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京污水脱氮除磷处理与过程控制工程技术研究中心，北京 100124）

为了解溶解氧对间歇曝气模式下亚硝酸盐氧化菌（NOB）种群结构的影响，在以城市污水为处理对象，以间歇曝气方式运行的SBR反应器中，检测两种主要 NOB菌（Nitrospira、Nitrobacter）在低溶解氧运行时期（55d）和高溶解氧运行时期（113d）数量及结构的变化.结果表明，在低溶解氧运行时期Nitrospira的含量远高于Nitrobacter的含量，与Candidatus Nitrospira defluvii相似性较高的菌种为Nitrospira的优势菌种；而进入高溶解氧运行时期后，Nitrospira含量逐渐降低，相反 Nitrobacter含量逐渐升高成为主要 NOB菌群，并且其大多数菌种与Nitrobacter winogradskyi菌相似.另外，在低溶解氧运行转变为高溶解氧运行阶段出现了一定的亚硝酸积累，并在Nitrobacter成为优势NOB菌群过程中逐渐消失.

溶解氧；亚硝酸盐氧化菌；Nitrospira；Nitrobacter

亚硝酸盐氧化菌（NOB）是生物法脱氮过程中硝化反应主要参与菌种之一［1-4］，其数量及种群结构也直接影响着污水处理工艺的硝化效果.然而在生物法污水处理工艺中，DO、pH值、温度等工艺参数或特殊运行方式均可能对NOB的种群结构产生的影响.因此，探究各类工艺参数及运行方式对NOB种群结构的影响对生物法脱氮技术具有较大理论及实际意义的.近年来，间歇曝气逐渐成为一种新型的运行方式应用于活性污泥法生物脱氮处理工艺中［5-8］.关于间歇曝气的研究主要集中于处理效果及启动短程硝化等方面，如：Li等［6］启动的间隙曝气反应器能够稳定的处理高氨氮废水；Yang等［5］运行的移动床生物膜反应器利用间隙曝气模式成功实现了短程硝化反硝化的脱氮方式.然而，关于间隙曝气模式中相关工艺参数（如溶解氧、pH值、间歇曝气时间）对硝化微生物影响的研究较少，且大多集中于硝化菌在活性污泥中的相对含量上［5-7］.关于对硝化微生物菌群结构，尤其是NOB菌菌群结构变化的研究一直鲜有报道.研究表明，Nitrospira和Nitrobacter是污水生物处理系统中最为常见的NOB种类［2-3］.其中 Nitrospira属于 Nitrospirae菌门并适合在低底物浓度条件下生长. Nitrobacter属于α-Proteobcateria菌门且更适应高底物浓度.而溶解氧是NOB菌完成硝化作用的必要因素之一，同时也是间隙曝气模式重要的工艺参数［2］.因此，本文以间歇曝气城市污水SBR硝化反应器为对象，研究不同DO浓度对两种主要NOB菌（Nitrospira、Nitrobacter）数量及种群结构变化的影响，进一步丰富间歇曝气运行方式的基础理论知识，为实际运行提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 试验装置与运行方式

试验装置SBR反应器容积为12L，有效容积10L，排水比为50%，污泥龄为30d.温度控制在（25 ±1）℃左右，pH值为 7.1～7.8，机械搅拌器转速为100r/min.每周期分为进水、曝气搅拌、沉淀、排水、闲置5个阶段，其中进水10min，曝气搅拌时间由 DO值实时检测系统控制（见 1.3），沉淀30min，排水10min，闲置10min.

1.2 试验用水及接种污泥

由于进水中有机物会导致反应器中异养菌大量生长，进而降低硝化菌含量.为此将反应器进水设定为一个城市污水有机物去除反应器的出水，从而提高反应器中硝化菌比例，更有利于开展反应器硝化菌菌群变化方面的研究.其水质指标为：pH：7.2～7.8；NH4+-N：50.2～80.4mg/L；NO2－-N：0.12～5.43mg/L；NO3--N：0.04～1.24mg/L，COD：40～55mg/L，其中COD多为不可降解有机物.接种污泥取自处理某居民区生活污水的低 DO中试SBR反应器，中试SBR硝化效果良好.

1.3 试验方案

反应器共运行165d，根据DO值不同可以分为2个阶段：I阶段为低DO运行阶段（0～55d），反应器DO浓度控制在0.2～0.5mg/L左右.当硝化结束时DO值出现骤升现象，实时控制装置在DO值到达 0.75mg/L时停止曝气搅拌进入沉淀阶段；II阶段为高 DO运行阶段（55～165d），反应器DO浓度控制在1.5～2.3mg/L左右.当硝化结束时DO值出现骤升现象，实时控制装置在DO值到达3mg/L时停止曝气搅拌进入沉淀阶段.

1.4 检测指标及分析方法

温度，pH及DO值均采用WTW Multi-340i及相应检测探头（WTW 公司，德国）进行在线监测；进出水中NH4+-N，NO2－-N 及NO3

－-N 浓度由Quickchem®8500流动注射仪（Hach公司，美国）进行检测；利用 Fast DNA Spin Kit for Soil（QBIOgen Inc.，Carlsba，CA，美国） DNA提取试剂盒提取反应器活性污泥样品的总DNA.

表1 试验所用引物及退火温度Table 1 Primers list and annealing temperature

定量PCR采用SYBR-Green法，Nitrobacter和Nitrospira所用引物见表1.定量 PCR扩增的20μL体系配置如下：10μL SYBR®Premix Ex Taq™ （Takara，Dalian，China）、 0.4μL ROX Reference Dye50，、0.2μL 前后引物、2μL 样品DNA.反应条件为：预加热96℃ 3min；随后进行35周期扩增反应（变性95℃ 30s，退火条件见表1，延伸72℃，30s）.对阶段I和II末的活性污泥样品中Nitrobacter和Nitrospira进行PCR反应，所用引物见表1.将扩增产物与pGEM-T Easy （Progmega，Madison， WI， USA）载体进行连接后，转化到BMJM109感受态细胞中，进行LB平板培养.经过蓝白斑筛选后，随机选取 100个阳性菌落进行PCR扩增鉴定，所用引物见表1.利用Hha I内切酶进行酶切分型，每种酶切类型选取至少 1个克隆菌株测序.所得序列应用NCBI-BLAST搜索相似序列，使用MEG4.1软件以邻接法构建进化树.

1.5 批次试验

批次试验用于检测低溶解氧末期反应器活性污泥氨氧化及亚硝酸氧化能力.试验如下：在低溶解氧末期，分别向5个2.5L锥形瓶中接种反应器活性污泥，MLSS为2000mg/L.人工配水使混合液NH4+-N为40mg/L、NO2－-N为 20mg/L，并控制温度24 ℃，pH值为7.2.5个锥形瓶DO浓度分别为 0.3、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L.每隔 10min取样一次，取样6次.检测NH4+-N、NO2－-N：及NO3

－-N含量，并根据结果计算氨氧化速率及亚硝酸氧化速率.

2 结果与讨论

2.1 溶解氧对Nitrospira及Nitrobacter数量的影响

Nitrobacter和Nitrospira是活性污泥处理工艺中主要的NOB种类，许多研究以这两种NOB种群来代表活性污泥中绝大多数NOB菌种［12-16］.因此，本研究利用定量PCR检测间歇曝气硝化反应器运行全周期过程中Nitrospira 和Nitrobacter含量的变化.如图1所示，在整个运行周期过程中均能检测到Nitrospira 和Nitrobacter的存在，但其相对含量随着溶解氧浓度的变化而变化.在低溶解氧运行阶段（DO：0.2～0.5mg/L），Nitrospira的拷贝数从 1.62×106copies/mL 增加至 3.52× 106copies/mL，而 Nitrobacter并没有显著增加，一直维持在 1.41×105～1.96×105copies/mL范围. Nitrospira的拷贝数在低溶解氧阶段高于Nitrobacter的拷贝数一个数量级，是此阶段反应器 NOB的优势菌种.其原因可能是某些Nitrospira能够适应低底物浓度的环境，在溶解氧匮乏的情况下Nitrospira较Nitrobacter更易生长繁殖［17］.当反应器进入高溶解氧运行阶段（DO：1.5～2.3mg/L）后，Nitrospira的拷贝数逐渐从3.52×106copies/mL下降至7.69×105copies/mL.相反地，Nitrobacter的拷贝数则显著增加最终上升至 7.39×106copies/mL，从而取代 Nitrospira成为反应器在高溶解氧阶段的优势 NOB菌种.研究表明，Nitrobacte与Nitrospira不同，其更适应高浓度底物环境，如高亚硝浓度、高溶解氧浓度［17］.因此，Nitrobacter可能同样能够适应高溶解氧间歇曝气的方式.

图1 反应器中Nitrospira和Nitrobacter含量的变化Fig.1 Number of Nitrospira and Nitrobacter in the reactor

与本研究结果相似，Liu等［15］证实其长期低溶解氧持续曝气的生物反应器中主要NOB菌种同样为 Nitrospira，且随着运行时间的增加Nitrospira含量不断增长；Zhang等［13］也证实在一个实际连续流短程硝化污水处理系统中Nitrobacter的含量随着溶解氧浓度的上升而增加.由此可见，在间歇曝气反应器中 NOB受溶解氧的影响趋势与已知的非间歇曝气反应器中没有较大的区别.

2.2 溶解氧对Nitrospira及Nitrobacter种群结构的影响

分别在低溶解氧阶段末期和高溶解氧阶段末期提取活性污泥进行克隆测序实验.基于Nitrospira 16s基因建立的系统发育树如图2所示.在低溶解氧周期末的活性污泥样品中，对 100个Nitrospira克隆子进行酶切分型可得到4个酶切类型（DL-1、DL-2、DL-3、DL-4）.从系统发育树可以看出，属于DL-1、DL-2和DL-3的克隆子与Candidatus Nitrospira defluvii有着较高的相似性，并且占总克隆子的94%.由于2.1结果显示Nitrospira为间歇曝气反应器低溶解氧阶段主要的 NOB菌群，因此可以推测出在低溶解氧间歇曝气模式下 NOB主要种群为 Candidatus Nitrospira defluvii菌属.Candidatus Nitrospira defluvii是一种常见 Nitrospira菌属，经常出现于低溶解氧环境下，如Park等［16］在其低溶解氧硝化反应器中发现 NOB的主要菌种为 Candidatus Nitrospira defluvii.

图2 Nitrospira系统发育树Fig.2 Phylogenetic trees constructed with the neighbor joining algorithm of Nitrospira sequences

图3 Nitrobacter系统发育树Fig.3 Phylogenetic trees constructed with the neighbor joining algorithm of Nitroacter sequences

而高溶解氧样品中Nitrospira可得到3个酶切类型（DH-1、DH-2、DH-3），其中属于DH-1的克隆子与仍与Candidatus Nitrospira defluvii有着较高的相似性，并且占总克隆子的84%.而与低溶解氧样品不同的是，约有10%的克隆子（DH-2）相似于 Nitrospira.mosocoviensis菌属，这是一类已被证实能够在较高浓度溶解氧条件下生长的Nitrospira菌种［16］.由此可见，当间歇曝气由低溶解氧转化为高溶解氧运行110d后，Nitrospira种群结构仍然以Candidatus Nitrospira defluvii菌种为主，同时也出现了一定含量的偏好高溶解氧的Nitrospira菌种.

与Nitrospira不同，反应器中Nitrobacter的种群结构在低DO与高DO阶段有着较大的区别.如图 3所示，在低溶解运行阶段反应器Nitrobacter含量较少时，对100个Nitrobacter克隆子进行酶切分型可得到5个酶切类型（DL-1、DL-2、DL-3、DL-4、DL-5）.其中DL-1、DL-2相似于uncultured Nitrobacter sp.Clone 6，占总克隆子的 82%；DL-3相似于 uncultured bacterium clone MBR447，占总克隆子的10%；DL-4、DL-5相似于uncultured Planctomycetes bacterium，占总克隆子的 8%.而转变高溶解氧运行模式后，反应器中Nitrobacter含量增加，高溶解氧末期污泥样品分型可得到 4个酶切类型（DH-1、DH-2、DH-3、DH-4）.其 98%的克隆子与 Nitrobacter winogradskyi具有较高的相似性，2%的克隆子与uncultured Planctomycetes bacterium相似.结合反应器在高溶解氧运行过程中 Nitrobacter的数量逐渐增加最终成为优势NOB菌种（见2.1节）的现象，可见高溶解氧间歇曝气的方式有利用Nitrobacter winogradskyi菌种的生长和富集.

综上所述，在间歇曝气的模式下，低溶解氧条件导致NOB的种群结构以Candidatus Nitrospira defluvii为主；而高溶解氧条件则导致NOB种群结构从 Candidatus Nitrospira defluvii转变为Nitrobacter winogradskyi为主.

2.3 NOB结构变化与出水水质变化的关系

由图4可见.反应器首先在低溶解氧条件下（0.2～0.5mg/L）运行了55d.进过4d的活性污泥驯化，反应器成功启动了较好的硝化效果.在这个低溶解氧阶段，进水中的NH+-N全部硝化为NO－

43-N，出水中几乎没有NO2－-N的存在，反应器处在全程硝化状态.然而在反应器进入高溶解氧阶段的第一天其出水便产生了 NO2－-N的积累（6.1mg/L）.并且NO2－-N积累现象逐渐增加，在运行了35d后出水NO2－-N积累率达到95%以上，反应器形成了明显的短程硝化状态.但是反应器的短程硝化效果并不稳定，在维持了60d左右后逐渐消失.反应器在高溶解氧阶段末期重新回归全程硝化状态.

许多研究表明，低溶解氧或间歇曝气的运行模式有利用于短程硝化的形成［6，18-19］，然而本研究中反应器在低溶解氧阶段并没有发生短程硝化现象.如图5所示，批次试验结果显示：在低溶解氧阶段末期，反应器活性污泥在低溶解氧浓度下（0.3，0.5mg/L），亚硝酸氧化速率高于氨氧化速率.这说明此时反应器活性污泥中NOB菌活性要高于AOB菌.而由2.1及2.2节分子实验结果可知，在低溶解氧阶段运行时期反应器中NOB主要以Nitrospira 中的Candidatus Nitrospira defluvii菌种为主.Candidatus Nitrospira defluvii具有与其他亚硝酸氧化菌不同的亚硝酸氧化还原酶（nitrite oxidoreductase，NXR），使其可以适应低底物浓度的环境，并且常出现于低溶解氧运行活性污泥反应器中［20］.因此，本研究中的反应器在低溶解氧运行时期具有较好的全程硝化效果可能是由于大量Candidatus Nitrospira defluvii菌的存在所导致的.

图4 反应器进出水水质变化Fig.4 Influent and effluent nitrogen concentration in the reactor

然而批次试验同时也表明，低溶解氧末期的活性污泥在高溶解氧条件下（1.0，1.5，2.0mg/L）亚硝酸氧化速率逐渐下降且均低于氨氧化速率，说明Candidatus Nitrospira defluvii菌活性被抑制.虽然具体的机理仍未明确，但推测可能是由于适应低溶解氧浓度的Candidatus Nitrospira defluvii菌种无法适应突然提高的溶解氧浓度，造成其亚硝化活性降低.而这种现象也导致了反应器从低溶解氧运行转变为高溶解氧运行初期，出水中产生大量亚硝态氮的积累及短程硝化的形成.不过出水中充足的亚硝态氮及高溶解氧条件十分利于另一种NOB菌——Nitrobacter菌的生长繁殖.因此当偏好高底物浓度的 Nitrobacter菌数量逐渐增加，并在高溶解氧中后期慢慢取代Nitrospira成为反应器优势 NOB菌种时，反应器中的短程硝化重新恢复为全程硝化.

图5 低溶解氧末期不同溶解氧对活性污泥氨氧化及亚硝酸氧化速率的影响Fig.5 Effect of DO on ammonia oxidation and nitrite oxidation of activated sludge at the end of low-DO period

3 结论

3.1 在间歇曝气硝化反应器中，低溶解氧有利于NOB菌中的Nitrospira的富集，而高溶解氧则有利于Nitrobacter的生长繁殖.

3.2 低溶解氧间歇曝气模式下，Nitrospira菌主要为Candidatus Nitrospira defluvii类菌属；高溶解氧间歇曝气则会促使 Nitrobacter倾向于Nitrobacter winogradsky菌属.

3.3 在溶解氧的转变过程中短程硝化现象的发生及消失是由于反应器优势 NOB菌从Nitrospira变为Nitrobacter而引起的.

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《中国环境科学》2011～2014年发表的论文中20篇入选“领跑者5000”提名论文

《中国环境科学》2011～2014年发表的论文中有20篇入选“精品期刊顶尖论文平台——领跑者5000”提名论文.“领跑者5000（F5000）”平台由中国科学技术信息研究所于2013年建设，旨在集中展示中国精品科技期刊上发表的最高端的学术研究成果，将与国际和国内重要检索系统链接，扩大论文影响.该平台将与汤森路透公司合作，拟利用WOK国际检索系统平台，与SCI数据库在同一平台内实现文献链接和国际引文检索，在更大范围内向世界科技同行展示和推广中国最重要的科研成果.提名论文均为 2011～2014年在学科领域内被引率排名居前的论文.本次环境学科共有65篇文章入选“领跑者5000”提名论文.

Effect of dissolve oxygen on the microbial community of the nitrite-oxidizing bacteria in an intermittent aeration reactor.

BAO Peng， WANG Shu-ying*， MA Bin， ZHANG Qiong， PENG Yong-zhen （Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering， Engineering Research Center of Beijing， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）. China Environmental Science， 2016，36（9）：2696～2702

Nitrospira and Nitrobacter are two dominant types of nitrite-oxidizing bacteria （NOB）.To evaluate the effect of dissolved oxygen （DO） on microbial community of NOB under the intermittent-aeration mode， the population and microbial community of this two NOB types were investigated in an aeration reactor with low DO period （55d） and high DO period （113d）. Results showed the population of Nitrospira was much higher than that of Nitrobacter during the low DO period （0.2～0.5mg/L）， and most clones of Nitrospira was very similar to the clone Candidatus Nitrospira defluvii. After increasing DO to a high level （1.5～2.3mg/L） and operating for 113d， Nitrobacter turned to the dominant group. Most clones of Nitrobacter were distributed to the branch containin Nitrobacter winogradskyi. Furthermore， the nitrite accumulation occurred in this reactor during the shift of population between Nitrospira and Nitrobacter after increasing DO， and it gradually disappeared when Nitrobacter became the dominant NOB group.

dissolved oxygen；nitrite-oxidizing bacteria；Nitrospira；Nitrobacter

X703

A

1000-6923（2016）09-2696-07

2016-02-25

国家自然科学基金（51578014）

* 责任作者， 教授， wsy@bjut.edu.cn

包 鹏（1985-），男，黑龙江哈尔滨人，北京工业大学环能学院博士研究生，主要从事生活污水脱氮除磷方面的研究.