高效液相色谱紫外检测法测定饲料中N-氨甲酰谷氨酸的含量

李 裕

（湖南省兽药饲料监察所，湖南长沙410006）

高效液相色谱紫外检测法测定饲料中N-氨甲酰谷氨酸的含量

李 裕

（湖南省兽药饲料监察所，湖南长沙410006）

本实验建立了高效液相色谱紫外检测法测定饲料中N-氨甲酰谷氨酸含量的方法。配合饲料样品用水提取后经混合型阴离子固相萃取柱净化富集。以甲醇-0.05%磷酸水溶液（V/V，5∶95）为流动相，C18色谱柱分离，检测波长215 nm。结果表明，在1.5～500 μg/mL浓度范围线性关系良好，R2=1，样品回收率为88.6%～101.2%，相对标准偏差为0.69%～2.31%（n=5），定量限为0.075 mg/g。可见本方法适用于饲料中N-氨甲酰谷氨酸的含量测定。

饲料；N-氨甲酰谷氨酸；高效液相色谱

N-氨甲酰谷氨酸是N-乙酰谷氨酸的稳定结构类似物，能激活动物体内氨甲酰磷酸合成酶-Ⅰ和二氢吡咯-5-羧酸合成酶，从而促进精氨酸的生成。精氨酸在调控动物机体营养代谢和免疫反应方面有重要作用，可提高多胎动物窝产仔数和初生重、促进幼龄动物生长和发育（Wu等，2004）。N-氨甲酰谷氨酸的成本仅为精氨酸的1/10（冯涛等，2012）。目前含有N-氨甲酰谷氨酸的饲料产品主要有饲料添加剂和配合饲料两大类。

目前报道的检测饲料中N-氨甲酰谷氨酸的方法有高效液相色谱电喷雾串联质谱法（梁婧等，2015；唐圣芸等，2014）。相比常见的高效液相色谱紫外检测法，串联质谱法对色谱条件、样品净化容忍度较高，而且灵敏度高、定性更准确，常用于复杂基质中极痕量物质的检测。但串联质谱仪器昂贵，运行和维护成本也较高，大部分饲料企业尚未配备。而且对于含量较高样品的检测，由于串联质谱上机的稀释倍数大、离子源的离子化效率及稳定性等因素，定量可能不如高效液相色谱紫外检测法准确。因此，本实验旨在建立一种适用于大多数饲料企业实验室使用，能准确测定饲料中N-氨甲酰谷氨酸含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器Waters 2695高效液相色谱仪配2489型紫外检测器、2998型二极管阵列检测器（美国Waters公司）；Delta 320型pH计（梅特勒-托利多公司）；OASIS MAX固相萃取柱（150 mg，6cc，美国Waters公司）。

1.2 试剂N-氨甲酰谷氨酸（纯度≥98%，Sigma公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）。

N-氨甲酰谷氨酸标准储备液：准确称取N-氨甲酰谷氨酸对照品102 mg置于100 mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，摇匀。该溶液浓度为1.0 mg/mL。

N-氨甲酰谷氨酸标准工作液：移取不同体积标准储液，用流动相配制成不同浓度标准工作液：1.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/mL。

1.3 样品前处理

1.3.1 饲料添加剂样品前处理准确称取饲料添加剂样品0.2 g置于100 mL容量瓶中，加入约70 mL水，摇匀，置超声清洗仪中超声约10 min，取出恢复至室温后，加水定容至刻度，摇匀。用去离子水稀释至合适的上机浓度，过0.22 μm针头式滤器，供高效液相色谱测定。

1.3.2 配合饲料样品前处理准确称取配合饲料1 g置于100 mL容量瓶中，加入70 mL水，摇匀，置超声清洗仪中超声约10 min，取出恢复至室温后，加水定容至刻度，摇匀。滤纸过滤后，用5%氨水溶液微调至pH≥6.5（如果样液pH本身大于6.5则不用调）。

1.3.3 过柱净化OASIS MAX固相萃取柱中加入5 mL甲醇进行柱活化，加入5mL水进行柱平衡，准确移取2mL样液加入柱中，使流速小于1 mL/min缓慢过柱；加入3 mL 5%氨水清洗，抽干；加入3 mL甲醇清洗，抽干；6 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脱入10 mL小烧杯。通风橱内65℃水浴。待液体挥发至干，准确移取1mL水加入小烧杯中，充分溶解后过0.22 μm针头式滤器，供高效液相色谱测定。

1.4 色谱条件色谱柱：菲罗门lunaC18柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸水溶液（V/V，5∶95）。流速：0.7 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30℃；检测波长：215 nm。

1.5 标准曲线的绘制将1.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/mL的对照品工作液，依次注入色谱仪，测定各浓度工作液的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.6 灵敏度的测定分别称取3份1.00 g空白配合饲料，按样品处理方法测定，测得基线噪音值，按10倍信噪比计算，得到方法的定量限。

1.7 回收率的测定

1.7.1 饲料添加剂回收率的测定自制N-氨甲酰谷氨酸含量分别为5%、10%、20%的混合型添加剂样品。每个含量的样品设置5个重复，按1.3.1方法进行处理后上机测定。采用外标法计算含量、回收率和相对标准偏差（RSD）。

1.7.2 配合饲料回收率的测定称取空白配合饲料，加入标准储备液，使添加浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%。每个含量的样品设置5个重复，按1.3.2方法进行处理后上机测定。采用外标法计算含量、回收率和相对标准偏差（RSD）。

2 结果

2.1 色谱图色谱图见图1～5。N-氨甲酰谷氨酸峰形完好，无杂峰干扰。

图1 N-氨甲酰谷氨酸标准溶液色谱图

图2 空白饲料添加剂色谱图

图3 饲料添加剂中添加N-氨甲酰谷氨酸色谱图

图4 空白配合饲料色谱图

图5 配合饲料中添加N-氨甲酰谷氨酸色谱图

2.2 线性范围与定量限检测线性方程为y= 0.0005x-0.6556，R2=1。在1.5～500 μg/mL浓度范围线性关系良好。本方法测定饲料中N-氨甲酰谷氨酸的定量限为0.075 mg/g（相当于含量0.0075%）。

2.3 准确度与精密度当饲料添加剂N-氨甲酰谷氨酸含量为5%、10%、20%时，平均回收率分别为101.2%（RSD=0.81%）、100.5%（RSD=0.76%）、99.7%（RSD=0.69%）。配合饲料中N-氨甲酰谷氨酸含量为0.05%、0.1%、0.2%时，平均回收率分别为88.6%（RSD=2.31%）、90.4%（RSD=1.96%）、92.3%（RSD=1.89%）。

3 讨论

3.1 流动相的选择N-氨甲酰谷氨酸有两个羧酸基团和一个N-氨甲酰基团。极性强的离子型化合物在C18色谱柱上几乎是不保留的。水相中含有一定量的磷酸，可抑制羧酸基团的离子化，增加保留时间。同时还可以抑制C18色谱柱上硅羟基的离子化，削弱COO-与Si-Oδ-Hδ+的相互作用，减小拖尾。本实验中磷酸加入量为0.001%～0.1%能满足检测要求。从保护色谱柱、缓冲能力两方面考虑，磷酸的加入量定为0.05%。乙腈的洗脱能力强，且目标化合物不溶于乙腈，所以不适合选用。本试验选择甲醇为有机相。甲醇比例降到色谱柱允许的5%时，随柱温变化，保留时间在7～12 min，可满足色谱分离的要求。

3.2 检测波长的选择N-氨甲酰谷氨酸在紫外检测器范围仅有末端吸收，在205～190 nm范围吸收值突跃很大。235～210 nm范围吸收值增加平稳，但吸收值不高。考虑到水、甲醇的紫外截止波长分别为200、205 nm。本试验不使用梯度洗脱，选择215 nm作为检测波长。

3.3 提取N-氨甲酰谷氨酸溶于水、甲醇，不溶于乙腈。用水、甲醇提取都能满足实验要求。用甲醇提取并未表现出提取液杂质较少的优势，原因可能是提取液中盐类等离子型化合物变少，但油脂、脂溶性维生素等干扰物质增加。因此，本实验选择水为提取溶剂。

3.4 净化有机酸类化合物适合使用阴离子柱进行纯化。离子交换时，样液的pH值很关键。由于柱容量的限制和色谱分离的需要，在保证N-氨甲酰谷氨酸完全阴离子化的同时，需尽量避免其他阴离子数量的增加，所以调节pH值的氨水不宜过量。样液中N-氨甲酰谷氨酸浓度较高时（如200 μg/mL），pH值5.2可保证N-氨甲酰谷氨酸阴离子化完全。样液中N-氨甲酰谷氨酸浓度较低时（如10 μg/mL），pH值6.5可保证N-氨甲酰谷氨酸阴离子化完全。

3.5 空白样品的选择含有N-氨甲酰谷氨酸的饲料产品目前仅有饲料添加剂和配合饲料两大类。饲料添加剂产品、混合型饲料添加剂产品的配物料通常有淀粉、谷氨酸钠、中草药提取物等。所以制备空白饲料添加剂样品时，按淀粉65%、谷氨酸钠25%、杜仲叶提取物5%、淫羊藿提取物5%的比例制成饲料添加剂空白样品。以验证这些物料对本方法是否有干扰。空白配合饲料使用某饲料厂家提供的不含N-氨甲酰谷氨酸的仔猪配合饲料。

3.6 添加浓度的选择饲料添加剂产品、混合型饲料添加剂产品中N-氨甲酰谷氨酸的含量一般为40%～80%。含量越高，就越容易测定。饲料添加剂选择5%、10%、20%三种含量做添加回收试验。N-氨甲酰谷氨酸在配合饲料中的加入量大多在0.09%～0.2%（冯涛等，2012；彭瑛等，2011）。所以配合饲料选择的添加浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%。

4 结论

建立了测定饲料添加剂、配合饲料中N-氨甲酰谷氨酸含量的高效液相色谱方法。本方法准确度、精密度、定量限均符合饲料中N-氨甲酰谷氨酸含量的检测要求，而且操作相对简单，对仪器设备要求不高，适合大多数饲料企业质检实验室使用。

[1]冯涛，白佳桦，闫学军，等.N-氨甲酰谷氨酸在养猪生产中的应用［J］.中国畜牧兽医，2012，39（10）：137～139.

[2]梁婧，徐懿，宋亮，等.HPLC-ESI-MS/MS法检测N-氨甲酰谷氨酸的含量［J］.畜牧与饲料科学，2015，36（5）：22～23.

[3]彭瑛，蔡力创.精氨酸和精氨酸生素对断奶仔猪生长性能、器官重及生化指标的影响［J］．中国畜牧兽医．2011，38（8）：23～26．

[4]唐圣芸，王远兴，温平威，等.高效液相色谱—电喷雾串联质谱法测定饲料中的N-氨基甲酰-L-谷氨酸［J］.色谱，2014，32（2）：184～188.

[5]Wu G，Knabe D A，Kim S W.Arginine nutrition in neonatal pigs［J］.The Journal of Nutrition，2004，134（10）：2783～2790.

A high performance liquid chromatography（HPLC）method was developed for the quantitation of N-carbamylglutamate in feed.Sample was extracted with water，and purified by anion exchange SPE cartridge.The HPLC separation was achieved on a C18 column using a mobile phase of methanol and 0.05%phosphoric acid aqueous solution（V∶V= 5∶95）.The UV detector was operated at 215 nm.The method provided good linearity from 1.5 μg/mL to 500 μg/mL（R2=1）. The recoveries were in the range of 88.6%～101.2%and the relative standard deviations（RSDs）were in the range of 0.69%～2.31%（n=5）.The quantification limit was 0.075 mg/g.It was a simple，rapid and reliable method for the determination of N-carbamylglutamate in feed.

feed；N-carbamylglutamate；high performance liquid chromatography

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161711

S816.17

A

1004-3314（2016）17-0041-03