牛羊肉毒梭菌（C型）灭活苗的研制及免疫效果观察

刘来利，李元新，王必成，冯玲霞，张鹏岳

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉 744000）

牛羊肉毒梭菌（C型）灭活苗的研制及免疫效果观察

刘来利，李元新，王必成，冯玲霞，张鹏岳

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉 744000）

采用我所分离并保存的对本地区牛羊肉毒梭菌病具有良好免疫原性的菌株Nb6514研制成功牛羊肉毒梭菌（C型）灭活苗。用免疫牛、羊血清作小白鼠体外中和试验来测定抗体效价，结果表明：结果显示，免疫10d的牛羊均可抗10个小鼠最小致死量/mL；30d分别可抗30～280和20～240个最小致死量/mL血清；180d达到高峰，分别可抗300～1600和200～1200个小白鼠最小致死量/mL血清；至550（一年半）仍可抗10个最小致死量/mL血清。结果表明研制的牛羊肉毒梭菌（C型）灭活苗具有良好的免疫效果，能有效预防牛羊肉毒梭菌（C型）病。

牛；羊；肉毒梭菌（C型）；灭活苗

肉毒梭菌是一种革兰阳性厌氧芽孢梭菌，其产生的肉毒毒素能引起人畜严重的中毒症状，甚至导致死亡。肉毒梭菌芽孢广泛分布于自然界，土壤为其自然的存留场所，动物肠道内容物、粪便、腐败尸体、腐烂饲料及其各种植物中都常含有肉毒梭菌芽孢，这种芽孢在适宜的条件下就能生长繁殖产生外毒素。C型肉毒素是迄今为止已知毒力最强的毒素，1mg纯毒约含1万个人的致死量或能使4×1212只小鼠致死。反刍类家畜牛、羊、骆驼及啮齿类动物鼠、兔、貂等对C型肉毒毒素特别敏感，非常容易引起中毒死亡。这种病常年均有中毒病例发生，以冬春秋末较为多见，而且发病可呈几年连续性，家畜中青壮年牛羊发病为多，病死率高达79.53%。对畜牧业造成严重的经济损失。为此，研制出用于预防C型肉毒梭菌中毒症灭活疫苗，并对免疫效果进行了观察，现报告如下：

1 材料

1.1 种 毒

制造与检验用的菌种为C型肉毒梭菌菌株，系1965年从甘肃省安西县（现为瓜州县黄牛体内），经中国兽医药品监察所鉴定为C型肉毒梭菌菌株。现由甘肃省畜牧兽医研究所保存。

1.2 菌种标准

1.2.1 形态和生化特性 本菌为革兰氏阳性粗大杆菌，陈旧培养物往往变成革兰氏阴性，产生偏端芽孢。生化特征应符合细菌分类学中本菌的特性。

1.2.2 培养特性 本菌为严格的厌养菌，在肉肝胃酶消化汤半固体培养基中呈中等生长，在厌气肉肝汤中生长不良或不生长，培养基中加入新鲜生肝块时，生长良好，产气，有臭味。在鲜血琼脂平板上厌氧环境条件下37℃培养48h，菌落不规则的圆形，直径3mm左右，半透明，边缘不整，有略大于菌落的溶血圈。

1.2.3 血清学特性 用肉毒梭菌定型血清作中和试验检查，应为C型。

1.2.4 毒力 各菌株用加入以无菌操作采取的新鲜生肝块的厌气肉肝汤或肉肝胃酶消化汤培养5～7d的菌液上清液0.00005～0.0001mL，腹腔注射体重250～300g豚鼠，应在7d内死亡。或以0.00001～0.00002mL静脉注射体重14～16g小白鼠，应在3d内死亡。

1.2.5 免疫原性 用体重1.5～2kg家兔4只，各皮下注射1mL。21d后连同条件相同的对照兔2只，各静脉注射10个致死量的毒素，观察14d对照兔应全部死亡，免疫兔应至少保护3只。

1.2.6 纯粹 用适宜培养基检查，应纯粹。

1.2.7 基础种子代数1～10代。

1.3 菌种保存

在2－8℃，保存期为10年。

1.4 试验动物

试验动物：豚鼠，体重300～400g；家兔，体重1.5～2.0kg；小白鼠，体重18～22g。

1.5 生产和检验用培养基

鱼（或）肉胃胃酶消化肉肝汤培养基；硫乙醇酸盐（TG）培养基，酪胨琼脂（GA）培养基和葡萄糖蛋白胨汤（GP）培养基（中国兽药监督所提供），普通琼脂斜面、厌气肉肝汤（甘肃省畜牧兽医研究所提供）。

1.6 佐 剂

氢氧化铝胶，购自甘肃省某药厂。

2 方法

2.1 生产用种子制备

2.1.1 一级种子繁殖及鉴定 将菌种接于厌气肉肝汤或肉肝胃酶消化半固体（含0.05%琼脂，0.5%明胶）培养基中，于37℃培养3d后，测毒及涂片镜检，应纯粹并用普通琼脂斜面、厌气肉肝汤及普通肉汤各 2管，每管接种 0.2mL，培养3～5d，应纯粹，即作为一级种子管，在2～8℃保存，使用期不超过15d。为便于使用，也可将产芽孢的菌种移植于加新鲜生肝块厌气肉肝汤中，在2～8℃保存，每3个月继代培养1次，在培养基上继代，不超过4代。

本试验菌种纯粹性检验采用上述方法，一级二级种子管培养基均采用保蒲氏胰酶消化半固体培养基培养保存备用。

2.1.2 二级种子繁殖 将一级种子1～2株，接种于培养中，置37℃培养3～5d，抽样做纯检，应纯粹，在2～8℃保存，应用期应不超过5d。

2.2 制苗用菌液制备

2.2.1 用培养罐或玻璃培养瓶培养 按容量装入80%左右的培养基，用玻璃瓶培养时加入1/10肝块，用反应缸时不加肝块，而按5:1加入氢氧化铝胶，混合后，118℃灭菌60min，玻璃瓶需或培养罐均需冷至37℃左右，按培养基总量的1% ～2%接入种子，同时加入灭菌的葡萄糖溶液，使其最终含量为0.5%，30～35℃静止培养5～7d，培养基如经存放，在接种前应煮沸驱氧，冷至37℃左右立即接种。

2.2.2 纯粹检验 菌液培养完成后，取样接种普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和普通肉汤各一管，每管接种0.2mL，培养7d，应纯粹。

2.2.3 毒素测定 每批抽样测定毒素。用体重14～16g的小白鼠静脉注射，1mL不应低于50000MLD。采用小白鼠腹腔注射测毒，剂量为0.5mL/只，毒素稀释液采用0.2%明胶磷酸盐缓冲液（pH为6.8）。采用10倍递度稀释。

2.2.4 灭活脱毒 培养罐（或玻璃瓶）培养，按菌液量0.8%加入甲苯醛溶液，并按0.01%加入硫柳汞；在37℃脱毒10d，摇瓶2次/d。

2.2.5 灭活检验 每瓶取样接种普通琼脂斜面、普通肉汤、加新鲜生肝块的厌气肉肝汤，或加0.05%琼脂、0.05%明胶的半固体培养基各1管，每管接种菌液0.2mL，在37℃培养5～10d，应无菌生长。

2.2.6 脱毒检验 在无菌检验同时，每瓶取样接种豚鼠，每只皮下注射4mL，观察7～14d不应死亡；或离心取上清液，静脉注射体重16～20g小白鼠2只，0.4mL/只，观察5d，不应死亡。如有豚鼠或小白鼠死亡，应继续脱毒。

2.3 配 苗 灭活检验合格后，玻璃培养的滤出肝块，按菌液5份加铝胶1份的比例加入无菌氢氧化铝胶，用8%氢氧化钠调节至pH7.0±0.2，充分摇匀。用反应缸加铝胶培养的菌液可直接调pH7.0±0.2，按配制后的总量的0.004%加入硫柳汞。

2.3.1 半成品检验 配苗完成后，取样做无菌检验。做厌氧性、需氧性细菌检验及霉菌及腐生菌检验（葡萄糖蛋白胨汤培养基G.P），灭菌效果检验（保蒲氏胰酶消化液半固体培养基），应无菌生长。

2.3.2 分装 经无菌检验合格后，进行定量分装，分装时应随时搅拌，使其混合均匀。2～15℃保冷暗处存。

2.4 成品检验

2.4.1 物理性状 本品静置后，上层为橙色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2.4.2 无菌检验 每批随机抽取5瓶灭活苗，混合后取1.0mL接种于含硫硫乙醇酸盐培养基（T.G）50mL，置37℃培养，3d后自小瓶中吸出培养物。分别接种T.G小管和酪胨琼脂培养基（G.A）各2支，0.2mL/支，1支置37℃培养；1支置25℃，另取0.2mL，接种1支葡萄糖蛋白胨培养基（G.P）小管置25℃，培养5d，观察有无细菌生长。

2.4.3 安全检验 每批苗用体重300～350g豚鼠4只，各皮下注射疫苗4mL观察21d。

2.4.4 效力检验 对不同批次的牛羊肉毒梭菌（C型）湿苗和干粉剂苗用体重1.5～2kg家兔4只，各皮下注射1mL。21d后连同条件相同的对照兔2只，各静脉注射10个致死量的毒素，观察14d。

2.4.5 免疫测定 用免疫牛羊血清作小白鼠体外中和试验，分别在10d、30d、180d、360d进行抗体效价测定。

3 试验结果

3.1 无菌检验 观察发现，接种湿苗的硫乙醇酸盐培养基（T.G）小管、酪胨琼脂斜面（G.A）和葡萄糖蛋白胨汤（G.P）及对照管均无细菌无细菌生长。

3.2 安全检验 3批湿苗接种检验用豚鼠后，试验豚鼠食欲正常，精神状态良好，10d后观察注射部位无坏死，均健活，安全检验合格。见表1

表1 灭活苗的的安全检验结果

3.3 效力试验 分别对三批温苗作近期效力试验，保护率结果见表2

表2 灭活苗近期效力试验结果

三个批次其中二个批次对10个致死量的C型肉毒梭菌毒素的保护率为100%，一个批次对10个致死量的C型肉毒梭菌毒素保护率为75%，对照组的死亡率为100%。

3.4 免疫测定 用免疫牛羊血清作小白鼠体外中和试验，分别在10d、30d、180d、360d进行抗体效价测定。

结果显示，免疫10d的牛羊均可抗10个小鼠最小致死量/mL；30d分别可抗30～280和20～240个最小致死量/mL血清；180d达到高峰，分别可抗300～1600和200～1200个小白鼠最小致死量/mL血清；至550（一年半）仍可抗10个最小致死量/mL血清。

4 小结与讨论

4.1 通过对我所所分离并保存的C型肉毒棱菌Nb6514菌株的抗原结构分析，毕获恩等研究表明，该菌株与其他5株（Nb6507、Nb6516、Nb65试、Nb6521、Nb6574）的毒素与抗毒素之间的交叉中和力基本一致，并与兰州生物制品所实验室保存的91号C型菌均有交叉保护作用。本项目虽用一株菌体制苗，但对其他菌株有较好地预防作用。

4.2 对研制的牛羊肉毒梭菌（C型）灭活苗进行了无菌检验和安全检验，试验结果表明安全可靠。

4.3 本试验免疫后10d的牛羊均可抗10个小鼠最小致死量/mL；180d达到高峰，分别可抗300～1600和200～1200个小白鼠最小致死量/mL血清；至550（一年半）仍具有较高的抗体水平，可抗10个最小致死量/mL血清。这对今后制定牛羊肉毒梭菌（C型）灭活苗的免疫程序和注射后抗体的跟踪监测提供了依据。

[1]张振兴，姜平平主编.实用兽医生物制品技术[M].北京：中国农业出版社，1996.5.

[2]朱力，等.肉毒毒素研究进展[J].生物技术通讯，2005（2）：186-190.

[3]包玉花，等.引进“血清中和试验法效检肉毒棱菌（C型）灭活疫苗”的试验总结[J].西藏科技，2003（5）：55-56.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.015

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目，项目编号：GNSW-2012-15

刘来利（1963～），甘肃省静宁县人，本科，副研究员，主要从事动物疫病防治与疫苗开发研究工作