川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

蒋德菊+夏荃+罗艺

【摘要】 目的：探讨川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞（ES）分化为心肌细胞的特征，建立简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系。方法：观察川芎含药血清作用下ES细胞活性，诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现，第5天达到高峰，约有70%的拟胚体产生跳动。用RT-PCR法在跳动的拟胚体中检测心肌细胞特异性标志物β-MHC的表达。结果：川芎含药血清培养下的细胞β-MHC的表达水平和分化率均明显升高，与大鼠血清组和胎牛血清组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：川芎含药血清可明显提高体外诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化的效率。

【关键词】 川芎； 胚胎干细胞； 细胞分化； 心肌细胞

【Abstract】 Objective：To explore the features of differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes induced by Chuanxiong containing serum，establish a simple and efficient system of ES cells differentiation cardiomyocyte.Method：The action of ES cell activity under Chuanxiong containing serum were observed，visible spontaneous and rhythmic beating embryoid bodies occurred at 3 d，reached peak at 5 d.Myocardial cell specific genes β-MHC were detected by using RT-PCR method.Result：Compared with the rat serum and fetal bovine serum group，theβ-MHC of the cells cultured by Chuanxiong containing serum expression and differentiation rate increased significantly，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Chuanxiong containing serum significantly improved the efficiency of embryonic stem cells differentiation to cardiomyocyte in vitro.

【Key words】 Chuanxiong； Embryonic stem cells； Cell differentiation； Cardiomyocyte

First-authors address：Longgang Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518116，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.005

心肌细胞移植在临床中已经广泛使用，移植细胞包括多种，其中最适合于移植的细胞为胚胎干细胞，主要是由于其具有较强的分化能力和增殖能力。胚胎干细胞分化为心肌细胞是研究心肌细胞分化机制的良好平台和模型[1-2]。随着现代药学的发展，人们更加重视中药的应用，中药历史悠久，很多中药均具有较好的活性，可用于疾病的治疗，其中保护心肌功能的中药应用也较为广泛，具有保护心肌、改善机体免疫功能、促进蛋白增长及防治细胞凋亡等特点[3-4]。与传统的化学药品相比，中药具有安全有效、价格便宜等特点[5-6]。本实验利用胚胎干细胞实验模型，对川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞进行实验研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 中药川芎含药血清的制备 选取健康未交配过的SD雄鼠30只[许可证编号：syxk（粤）2013-0085，广州中医药大学实验动物中心]，个体质量（200±10）g，适应性饲养3 d后进行实验。将其随机分为空白对照组、低剂量组及高剂量组，每组10只。给予大白鼠川芎水煎液灌胃（取一定量川芎饮片置容器中，加水没过药面，浸泡30 min后，煎煮3次，60 min/次，合并水煎液，过滤，浓缩至含生药1 g/mL备用），低剂量组的剂量约为正常用量（0.8 g/kg）的5倍，为4 g/kg，2次/d，连续3 d；而高剂量组则为正常用量的30倍，为24 g/kg，

2 次/d，连续3 d，空白对照组灌生理盐水（4 mL/kg）。人与大鼠动物等效剂量系数由《实验动物学》可知为6.3。每次给药10 min后，对其进行取血，将血液静置2 h后离心（离心条件：3000 r/min，离心10 min），离心后取上清液56 ℃加热30 min，过滤，保存于-20 ℃。体外含药血清按20%计算[7-10]。

1.2 胚胎干细胞培养

1.2.1 来源与试剂 小鼠胚胎干细胞选自中科院生化细胞研究所[11-12]；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、明胶、β-巯基乙醇（β-ME）、丝裂霉素C、非必需氨基酸（NEAA）购自美国GIBCO公司，白血病抑制因子（LIF）购自法国Millipore公司。

1.2.2 胚胎干细胞培养与诱导分化 将冻存在液氮罐中的胚胎干细胞取出，于37 ℃水浴锅中迅速融化，将细胞立即转移至10 mL的ep管中，加入适量的培养基，采用300 rcf，10 min离心，去除上清液，加入1 mL培养基吹打，转移细胞并进行培养，当细胞生长至70%左右时，对细胞进行传代。培养液分四组，即：川芎血清低剂量组、川芎血清高剂量组、大鼠血清组、胎牛血清组，将收集到的川芎含药血清和大鼠血清、胎牛血清，配制成10 mL备用，各组培养液终浓度为20%。（1）悬滴培养：ES细胞中加入20%川芎含药血清（低剂量组和高剂量组）的分化培养液，将细胞密度设置为3.75×104/mL。细胞培养在6 cm培养皿中，取1.6 mL细胞置于10 cm的培养皿内盖上，将内盖翻转使其生长，加入5 mL PBS，孵育1 h。（2）悬浮培养：细胞孵育后对细胞进行观察，控制细胞悬滴液中细胞个数为1，第2天于倒置显微镜下观察，每个悬滴内均含有1个，吸去PBS，加入分化培养基，移至6 cm中培养，孵育2 h。（3）贴壁培养：细胞培养2 d后，观察细胞个数，大约为10个，接种至4孔板，第3天时肉眼观察每个培养皿中均可见数十个EBs。分别接种至事先用明胶包被的24孔板内，每孔中加入2 mL分化培养液。

1.3 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达 实验细胞分四组，即川芎血清低剂量组，川芎血清高剂量组，大鼠血清组和胎牛血清组，每组6孔。提取总RNA并测定浓度，分析其完整性，进而合成cDNA，β-MHC Forward：5-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3，Reverse：5-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3；GAPDH Forward：5-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3Reverse：5-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3[4-5]。PCR体系为：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR MasterMix，2.5 μL样品溶液，1.0 μL引物加水至25 μL。反应条件：95 ℃下加热60 s，进行预变性；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此循环40次。扩增后的产物主要是采用荧光检测，用ABI 7500 Software v2.0软件对其进行分析，绘制曲线表，计算Ct值，对系统数据处理后可以得出不同浓度对于细胞分化的影响。

1.4 统计学处理 使用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 川芎诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化 细胞培养2 d后呈密集状态，一般为圆形，细胞界限和形态不明显（图1）；体外细胞个头小，但生长速度快（图1～2）。川芎分化液培养3 d的胚胎干细胞会收缩配体，导致培养时间增加，收缩越明显，则时间越长。自发节律性收缩区域较大，且细胞形态较单一（图3～4）。于细胞培养的第3 d可见零星EB球发生自发性节律性跳动，5 d时约有70%的EB球出现节律性跳动，低、高剂量川芎血清组（图3～4）EB球发生自发性节律性跳动的细胞数量明显多于胎牛血清（图1）和大鼠血清组（图2）。

2.2 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达 川芎低、高剂量含药血清组β-MHC表达量均明显高于胎牛血清组和大鼠血清组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；川芎低剂量组β-MHC分化率明显高于高剂量组，比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

3 讨论

随着人们生活水平的进步，大部分人均处于亚健康状态，心血管疾病是临床上常见的疾病。心血管疾病的临床突破主要来自胚胎干细胞的发展，胚胎干细胞会根据诱导自发分化成多种细胞，如心肌细胞和血管内皮细胞等[13-15]。心肌细胞对于恢复正常供血、免疫功能均有重要的意义[16-17]。一般情况下，胚胎干细胞能够自然分化，但分化率低，因此提高分化率显得至关重要。临床上对于胚胎干细胞的研究较为广泛，但是研究方向各不相同，关于中药的研究更是凤毛麟角，因为涉及人体、细胞、动物等各个方面，给研究工作带来了一定的困难，但也有部分学者取得了可喜的成果[18-19]。有研究方向为将细胞采用不同密度制成悬浮液，采用不同的方法和改变环境进行培养，分析其分化成心肌细胞的分化率。最后对具有促进分化功能的中药进行相关的安全性评价，致力应用于临床。川芎是伞形科藁本属植物，经研究表明，其具有多种临床功效，如使血管扩张、增加脑部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本课题组在研究川芎含药血清的胚胎毒性时发现川芎含药血清对胚胎干细胞转化为心肌细胞有促进作用（P<0.05），而且尤以低剂量组为明显，遂建立川芎诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化方法，可以提高胚胎干细胞的分化率，有利于体外获得相关的大量心肌细胞，将其应用于临床研究以及药物的研发和筛选。

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（收稿日期：2016-07-28） （本文编辑：李颖）