TGA与LPS竞争抑制妊娠期糖尿病孕妇外周血单核细胞TLR4经典信号通路

杨 琴，丛 林， 袁 静，方慧琴，陈 薇，李 松，李 琴



TGA与LPS竞争抑制妊娠期糖尿病孕妇外周血单核细胞TLR4经典信号通路

杨 琴，丛 林， 袁 静，方慧琴，陈 薇，李 松，李 琴

目的 研究半乳糖醛酸(TGA)与内毒素(LPS)同时刺激妊娠期糖尿病孕妇外周血单核细胞及其对LPS-Toll样受体4(TLR-4)-核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的抑制作用。 方法 选取妊娠期糖尿病孕妇30例，抽取外周静脉血15 ml，分离出单核细胞，分别加入LPS、TGA、TGA(0～1.0 mg/ml)联合LPS刺激并培养，Western blot法检测TLR4及NF-κB p65蛋白表达量，ELISA法检测培养液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-10(IL-10)水平。 结果 单独LPS或TGA刺激，其下游TLR4、NF-κB p65蛋白表达量及TNF-α、IL-1、IL-10水平均较未处理组高，差异有统计学意义(P<0.05)；同时加入TGA及LPS刺激，其TLR4、NF-κB p65蛋白表达量及TNF-α、IL-1、IL-10水平均较单独LPS或TGA刺激低，但较未处理组高，差异均有统计学意义(P<0.05)；各组TLR4与NF-κB p65蛋白表达量之间呈正相关性(P<0.01)。结论 TGA与LPS可竞争抑制LPS-TLR4-NF-κB信号通路，对妊娠期糖尿病的预防及治疗起到指导作用。

半乳糖醛酸；内毒素；妊娠期糖尿病；TLR4信号通路

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)所带来的不良妊娠结局及远期影响危害较大，近年越来越引起大家的关注，对其机制的研究也越来越多。研究[1]表明GDM与免疫炎症相关，认为GDM是一种慢性低度炎症性疾病。前期研究[2]表明GDM孕妇体内Toll样受体4(Toll-like receptor-4，TLR-4) mRNA、核转录因子-κB(nuclear transcription factor，NF-κB) mRNA呈高表达，炎症因子升高，提示存在免疫炎症，内毒素(lipopolysaccharide，LPS)-TLR4-NF-κB信号通路介导了大量炎症因子释放，可能参与了GDM的发病。基于此可针对TLR4信号通路进行调控，观察其是否对GDM有影响，有研究者运用半乳糖醛酸(trigalacturonic acid，TGA)类物质调控TLR4信号通路并对其分子机制做了探讨[3]。该实验即应用TGA对LPS-TLR4-NF-κB信号通路进行调控，并探讨其与GDM的关系。

1 材料与方法

1.1 实验分组 GDM孕妇30例，纳入标准参照国际妊娠合并糖尿病研究组(IADPSG)标准[4]，年龄21～34(28.20±3.46)岁，孕24～28(25.83±1.14)周。未做任何处理的作为空白对照组，只加LPS(1 μg/ml)刺激作为LPS组，只加TGA(1.0 mg/ml)刺激为TGA组，余除了加LPS(1 μg/ml，参照前期研究[2])刺激外，同时加入TGA刺激，并按加入的TGA浓度(0.25、0.5、1.0 mg/ml)分为0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组、1.0 mg/ml TGA组。同时排除胎膜早破、肝肾功能损害、感染、妊娠期高血压、妊娠期子痫及GDM高危因素等。所有受试者签署知情同意书，方案已经医院伦理委员会讨论通过。

1.2 标本收集及细胞培养 外周血经肝素化处理后，用人淋巴细胞分离液提取淋巴细胞(按说明书操作)，洗涤提纯后用血细胞计数板计数，调整细胞浓度并用台盼蓝测定细胞活力。将细胞置于RPMI 1640培养基中，按上述分组进行处理后，均置入37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。

1.3 试剂 人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；LPS、台盼蓝、TGA(美国Sigma公司)；RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；RIPA裂解液、蛋白缓冲液、蛋白A+G琼脂糖珠(上海碧云天生物技术有限公司)；小鼠抗人TLR4抗体、小鼠抗人泛乙酰化赖氨酸抗体(英国Abcam公司)；小鼠抗人NF-κB p65抗体、β-actin(美国CST公司)；山羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；ECL显影液(美国Thermo公司)；ELISA试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)。

1.4 ELISA法检测 培养液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)水平按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.5 Western blot法检测TLR4、NF-κB蛋白表达量 RIPA裂解液低温裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液加入5×蛋白上样缓冲液，煮蛋白10 min，样品保存于-20 ℃冰箱。10% SDS-PAGE电泳分离总蛋白，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜后放入NF-κB p65抗体(1 ∶250)和β-actin(1 ∶1 000)中4 ℃过夜。洗膜，放入二抗(1 ∶1 000)37 ℃孵育2 h，ECL显影液显影。

2 结果

2.1 各组之间TNF-α、IL-1、IL-10水平比较 TGA组、0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组、1.0 mg/ml TGA组分别与空白对照组、LPS组进行方差分析，TGA组TNF-α、IL-1、IL-10与空白对照组、LPS组比较，差异有统计学意义(F=225.876、289.244、399.918，P<0.01)；与空白对照组、LPS组比较，0.25 mg/ml TGA组TNF-α、IL-1、IL-10(F=213.266、251.172、353.225，P<0.01)、0.5 mg/ml TGA组TNF-α、IL-1、IL-10(F=188.278、223.004、321.683，P<0.01)、1.0 mg/ml TGA组TNF-α、IL-1、IL-10(F=268.099、234.759、410.713，P<0.01)，差异有统计学意义。

2.1.1 各组TNF-α水平比较 空白对照组与LPS组进行比较，TGA组及0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组、1.0 mg/ml TGA组分别与空白对照组、LPS组进行两两比较，结果显示，空白对照组与LPS组差异有统计学意义(P<0.05)，LPS组、TGA组、0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组、1.0 mg/ml TGA组分别与空白对照组比较，差异有统计学意义，LPS组与TGA组比较差异无统计学意义，0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组、1.0 mg/ml TGA组分别与LPS组比较，差异有统计学意义，见图1A。

2.1.2 各组IL-1水平比较 各组之间的比较方法同TNF-α，结果显示，空白对照组与LPS组之间差异有统计学意义(P<0.05)，TGA组、0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组分别与空白对照组比较，差异有统计学意义，而1.0 mg/ml TGA组与空白对照组差异无统计学意义；LPS组、TGA组之间差异无统计学意义，0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组、1.0 mg/ml TGA组分别与LPS组比较，差异有统计学意义，见图1B。

2.1.3 各组IL-10水平比较 各组之间的比较方法同TNF-α，结果显示，空白对照组与LPS组之间差异有统计学意义(P<0.05)，TGA组、0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组分别与空白对照组之间比较，差异有统计学意义，而1.0 mg/ml TGA组与空白对照组差异无统计学意义，TGA组、0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组、1.0 mg/ml TGA组分别与LPS组比较，差异有统计学意义，见图1C。

2.2 外周血单核细胞TLR4、NF-κB p65蛋白表达 与空白对照组比较，LPS组、TGA组TLR4、NF-κB p65蛋白条带较深；0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组、1.0 mg/ml TGA组TLR4、NF-κB p65蛋白条带较B、C组逐渐变淡，其中1.0 mg/ml TGA组蛋白条带最淡，见图2。TLR4、NF-κB p65蛋白表达量LPS组、TGA组较空白对照组多，0.25 mg/ml TGA组、0.5 mg/ml TGA组、1.0 mg/ml TGA组逐渐减少，见表1。

表1 各组TLR4、NF-κB p65 蛋白表达量比较

与空白对照组比较：*P<0.05；与LPS组比较：#P<0.05

2.3 外周血单核细胞TLR4、NF-κB p65蛋白表达量之间的相关性分析 各组的TLR4与NF-κB p65蛋白表达量之间呈正相关性(r=0.882、0.838、0.939、0.868、0.846、0.853；P<0.01)。

3 讨论

GDM是指妊娠期发生的不同程度的糖代谢异常[5]。近期许多研究[6-7]表明炎症因子与糖尿病之间密切相关，且课题组前期研究[8]表明甘露糖结合凝集素下降可能与炎症反应相关，初步探讨了GDM与免疫炎症之间的关系。近期研究[2,9-10]显示LPS-TLR4-NF-κB信号通路参与炎症因子的释放，可能参与了GDM的发病。TLR4可表达于免疫细胞胞膜上[11-13]，与胞外LPS结合并介导信号途径，激活下游系列信号，并最终使转录调节因子NF-κB活化，进入胞核启动转录。

图1 各组TNF-α、IL-1、IL-10水平

A：TNF-α；B：IL-1；C：IL-10；1：空白对照组；2：LPS组；3：TGA组；4：0.25 mg/ml TGA组；5：0.5 mg/ml TGA组；6：1.0 mg/ml TGA组；与空白对照组比较：*P<0.05；与LPS组比较：#P<0.05

图2 Western blot法检测各组TLR4、NF-κB p65蛋白表达

1：空白对照组；2：LPS组；3：TGA组；4：0.25 mg/ml TGA组；5：0.5 mg/ml TGA组；6：1.0 mg/ml TGA组

TLR4信号通路参与多种疾病的发生，研究[14-15]显示在肠道炎性疾病中通过5-TGA调控LPS-TLR4-NF-κB信号通路，下游表达产物减少，对通路起到抑制作用，但其具体机制并不完全清楚。而秦文星[3]则更深入的研究了其抑制作用的分子机制，认为TLR4的配体至少需要乙酰基结构与阴离子基团，LPS具备这个条件；而5-TGA中的羧基，既属于阴离子基团，又有酰基的结构特点，也具备与TLR4结合的条件，但LPS与TGA同时作用于TLR4时对TLR4信号通路产生抑制作用。

本研究则运用TGA对TLR4信号通路进行调控，结果显示TNF-α、IL-1、IL-10水平LPS组较空白对照组高，与前期研究[2,9]结果一致；TGA组细胞因子水平较空白对照组高，与LPS组无明显差异，提示TGA可能与LPS有相同的作用，即可与TLR4结合并激活下游信号通路；TGA浓度(0.25、0.5、1.0 mg/ml)的变化，细胞因子水平逐渐降低，在1.0 mg/ml浓度时最低，提示TGA、LPS同时与TLR4作用时可能使下游信号途径受到抑制，最终导致细胞因子释放减少。

本研究选取TLR信号通路TLR4、NF-κB p65蛋白这两个关键点对其进行监测，结果表明LPS组、TGA组与空白对照组比较，其TLR4、NF-κB p65蛋白条带加深，其蛋白表达量升高；LPS组、TGA组蛋白条带深浅较一致，表达量无明显差异；LPS+TGA组随着TGA浓度的变化，其蛋白条带较LPS组、TGA组逐渐变淡，其中LPS+1.0 mg/ml TGA组蛋白条带最淡，表达量也逐渐降低。TLR4、NF-κB p65蛋白表达量变化趋势与细胞因子变化趋势相同，本研究对TLR4与NF-κB p65蛋白表达量做相关分析，结果显示各组两者均呈正相关性，可认为TGA/LPS介导了TLR4-NF-κB 信号通路。由细胞因子及蛋白表达量变化水平可得知，TGA可激活TLR4信号通路，LPS与TGA同时与TLR4作用可抑制此通路，且LPS+1.0 mg/ml TGA作用最明显，可视为最适抑制浓度。

TGA也有羧基，具备与TLR4结合的条件，且TGA浓度的选择是根据5-TGA的最适浓度(1.0 mg/ml)[14]上下波动进行预实验摸索得出，因此其单独使用与LPS有相同的作用，使得TGA组与LPS组蛋白及细胞因子变化趋势一致。TGA对通路竞争抑制的可能原因是其使细胞膜上的TLR4受体减少，或TGA-TLR4作用位点与LPS-TLR4作用位点相互干扰，但其具体机制尚需进一步探讨。而且，本研究只限于体外细胞刺激，体外环境不受机体内环境的影响，因此TGA是否适用于机体以及其安全性等问题需进一步探究。

综上所述，TGA可激活TLR4信号通路，也可与LPS竞争抑制GDM孕妇外周血单核细胞LPS-TLR4-NF-κB信号通路，此通路的抑制为GDM的靶向治疗提供理论依据，有利于GDM防治工作的开展。

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Trigalacturonic acid competing with lipopolysaccharide inhibit the TLR4 signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells of gestational diabetes

Yang Qin, Cong Lin,Yuan Jing,et al

(Prenatal Diagnosis Center, Dept of Obstetrics and Gynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Objective To study the inhibition of trigalacturonic acid and lipopolysaccharide(LPS) in LPS-TLR4-NF-κB signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells of gestational diabetes. Methods 15 ml of peripheral venous blood was obtained from 30 pregnant women with gestational diabetes and mononuclear cells were isolated. They were cultured with LPS, trigalacturonic acid(TGA), LPS combining with TGA respectively.Western blot and ELISA were used to detect the expressions of TLR4, NF-κB p65 and the level of TNF-α,IL-1,IL-10. Results The expressions of TLR4, NF-κB p65 and the TNF-α, IL-1, IL-10 were higher than the control after stimulated with LPS alone or TGA. And the difference was clearly statistically significant(P<0.05). The expressions of TLR4, NF-κB p65 and the TNF-α, IL-1, IL-10 were lower compared with LPS alone or TGA when stimulated with LPS combined with TGA. However it was high compared with the control. The differences were both clearly statistically significant(P<0.05).And the correlations between the TLR4 and NF-κB p65 were clearly statistically significant (P<0.01). Conclusion Trigalacturonic acid competing with LPS may inhibit the TLR4 signaling pathway in peripheral blood mononuclear cells of gestational diabetes. And it can provide a guide to the prevention and treatment of gestational diabetes mellitus.

trigalacturonic acid; endotoxin; gestational diabetes mellitus; TLR4 signaling pathway

时间：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.046.html

安徽省自然科学基金(编号：1208085MH172)；安徽高校省级自然科学研究项目(编号：KJ2011Z215)

安徽医科大学第一附属医院妇产科产前诊断中心，合肥 230022

杨 琴，女，硕士研究生；

丛 林，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：conglin1957@163.com

R 714.5

A

1000-1492(2016)01-0098-05

2015-09-30接收