FTIR结合聚类分析法在姜科植物物种分类及鉴别中的应用

刘艳,司民真,李家旺,张川云,张德清,李伦,熊洋

(1.云南师范大学物理与电子信息学院,昆明 650500;2.楚雄师范学院光谱应用技术研究所,云南省高校分子光谱重点实验室,楚雄 675000)



FTIR结合聚类分析法在姜科植物物种分类及鉴别中的应用

刘艳1,2,司民真2*,李家旺2,张川云2,张德清2,李伦2,熊洋2

(1.云南师范大学物理与电子信息学院,昆明 650500;2.楚雄师范学院光谱应用技术研究所,云南省高校分子光谱重点实验室,楚雄 675000)

利用傅里叶变换红外光谱仪分别检测17种姜科植物的的光谱特征,并通过系统聚类和相关性系数法来探讨各植物间的亲缘关系。结果显示,聚类分析树系图和相关性分析结果相吻合,当花叶山姜和黑果山姜的距离系数为1(最小),相关系数为0.991(最高),亲缘关系最近。该研究得出同亚属植物间、野草果与山姜属植物属近缘种,支持了顶花莪术、温郁金在分类系统中的独立性,建议划分为独立种。聚类分析中姜科植物种间的聚合较好,物种鉴定正确率达到100%。因此,FTIR结合聚类分析法在姜科植物物种分类及鉴别中是一种可行性手段。

傅里叶变换红外光谱;姜科植物;相关性; 分类

1 引言

姜科草本植物是我国重要的中药材之一,它的根茎,味辛、性温,有抗氧化、开胃健脾、防暑、降温、提神、杀菌解毒的功效,常用来抑制肿瘤、促进食欲、脾胃虚寒、恶心呕吐、 鼻塞头痛等。红豆蔻、云南草蔻、长柄山姜是山姜属植物,已被收载于《中华本草》。宽丝豆蔻、荽味砂仁、野草果是豆蔻属植物；郁金、印尼莪术、温郁金、顶花莪术是姜黄属植物。其中红豆蔻、云南草蔻、野草果、郁金、温郁金等已被收录于《中国药典》。在《中国药典》(2005年版)收录的中药材郁金是该属植物温郁金等的干燥块根,近莪术类药材的干燥块根也可作为郁金药用[1]。其次,姜科植物中的名称大多是“豆蔻”“砂仁”“郁金”“莪术”“山姜”等易混学名,为此,药学及分类出现混杂现象,传统分类学也难以分清各姜科植物间的亲缘关系。因此,对姜科植物的物种分类及鉴别是临床应用和鉴别检验的研究关键。

近年来,用红外光谱法来探讨不同类群间的亲缘关系及物种鉴定已有很多报道,涉及种类繁多。有被子、蕨类、苔藓植物等[2],这在植物分类学中对培育新品种选取母本植物非常有意义。国内许多专家学者对姜科植物的识别、鉴定和分析也做了许多工作。目前,对姜科植物的研究主要有DNA条形码鉴定研究[3],根据来源、功效、成分、性状来进行区别[4],显微鉴别[5],薄层色谱鉴别以及多态性分析技术(RAPD)[6]等。与这些方法相比,傅里叶变换红外光谱法改善了其它方法费时费力、制样复杂、重复性不好的缺点,还具有特征性强、信息量大、结果可靠等优点。本文将首次利用傅里叶红外光谱法结合聚类分析为姜科植物分类及亲缘关系分析提供一种快捷、准确的振动光谱鉴别方法。红外光谱分析技术用于姜科植物的分类、亲缘关系、品种鉴定研究尚未见报道。

2 实验部分

2.1 实验仪器

红外光谱仪为Thermo Scientific NicoletTMiSTM5 spectrometer傅里叶变换红外光谱仪,扫描范围4000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,扫描次数16次。

2.1.1 样品来源、制备、检测及数据处理

本实验材料均采自于西双版纳。取同一时期17种药材的根来进行测试,具体样品见表1。样品清洗后晾干,经粉碎后过100目筛,取适量进行研磨成粉末,用电子天平称取1 mg的粉末样品和100 mg的溴化钾,按1∶100的比例混合后搅磨均匀,压片测红外光谱。同一种植物测5个光谱,前4个用来计算平均光谱,后一个用来作待测样品。光谱均扣除溴化钾背景,光谱数据用Omnic8.0软件进行自动基线校正、纵坐标归一化、9点平滑、二阶导数处理,应用IBM Spass Statistics 20进行系统聚类和相关性分析。

Table.1 Sample table of Zingiberaceae plants

3 结果与分析

3.1 谱图解析及聚类、相关分析的数据选择

图1是17种姜科植物的平均红外光谱图。从图1中可见,不同种姜科植物的红外振动光谱比较相似。为了便于比较分析,将17种植物的共有谱峰振动及归属情况归结于表2。由图1、表2结合参考文献[7-9]对谱带进行归属分析：在3000～2800 cm-1范围内为亚甲基碳氢伸缩振动,归属为挥发油类的贡献。1736 cm-1处的吸收峰可能来自于鞣质、黄酮类C=O的伸缩振动峰;1635 cm-1附近的吸收峰强而宽,可能含有N-H的弯曲振动,归属为蛋白质的酰胺Ⅰ带;1516 cm-1附近的峰归为芳香族化合物的特征峰。1425～1300 cm-1波段的吸收峰来自C-H键的振动吸收。1300～1200 cm-1范围的峰归属为酚类中C-O和蛋白质中的C-N伸缩振动峰的叠加区域。1200～1000 cm-1范围内主要有糖类和皂苷类物质的贡献。900～700 cm-1波段主要包含C-O、C-N、C-C的伸缩(弯曲)振动吸收峰。以上分析的结构特征与其他研究者报道姜的化学成分主要含有挥发油、二苯基庚烷、黄酮、鞣质、多糖、氨基酸等化合物相吻合[7]。从图1和表2可得出,17种姜科植物在4000～1000 cm-1的红外峰共有11个,在峰位相差5cm-1以内,共有峰为9个,占总峰数的82%,这表明17种姜科植物所含的化学成分大体相似。

图1中,直观可看到1800～1000 cm-1范围内的峰强和峰形有差异,其中苯环的骨架振动区域1600～1400 cm-1、糖类的特征区域1200～1000 cm-1范围的峰形和峰强有明显的差异。比如图1a中,节鞭山姜、红豆蔻、宽唇山姜、云南草蔻有糖类特征峰1105、1155、1078 cm-1阶梯峰,而其余几种没有；图1b中,吕氏砂仁的糖类特征峰1099 cm-1附近的吸收峰尖锐而单一,宽丝豆蔻、荽味砂仁、温郁金的糖峰钝而宽,明显异于其它药材的阶梯峰,这说明不同种药材中糖的类型和含量存在很大的不同。根据1800～1000 cm-1范围内谱峰所包含的信息归属和吸光度特点,特征性较强,信息量较大,因此选用1800～1000 cm-1波段作为姜科植物光谱聚类和相关分析的数据建立模型。

Fig.1 FTIR Average spectra of 17 Zingiberaceae

A:A.pumila,B:A.Kwangsiensis,C:A.Formosana,D:A.conchigera,E:A.hainanensis,F:A.galanga,G:A.Petaloideum,H:A.blepharocalyx,K:A.Nigra.a:A.platychilus,b:C.wenyujin,c:A.coriandriodorum,d:lushisharen,e:A.koenigii,f:C.Aromatica,g:C.xanthorrhiza,h:C.yunnanensis.

Table.2 The characteristic peak FTIR data of Zingiberaceae

3.2 聚类分析

聚类分析(cluster analysis)是一类将样品按相似程度(距离远近)划分类别,使得同一类中的元素之间的相似性比其他类的元素的相似性更强。选用1800～1000 cm-1波段的原始光谱数据进行建模,其分类效果不太理想,种间的聚类效果错误率很高,这可能是原始数据中关键峰重叠或隐藏所致。再次对此波段的数据进行二阶导处理,二阶导能更好的将重叠峰分裂开来,将更大程度地丰富信息量,从而进行聚类建模。

Fig.2 Cluster analysis of FTIR fingerprint of 85Zingiberaceaesamples

基于余弦距离,应用系统聚类中的组间联接法表征17种姜科植物85个样品的树系图(见图2)。参照传统分类,对树系图进行分析。当图2中距离为3时,野草果有2个样品独立成一类,吕氏砂仁有2个样品和长柄山姜聚在一起；当距离为5时,每种植物的5个样品全聚在一起,聚合度较好,正确率达100%。

基于此模型,取每种植物的4条光谱进行平均光谱处理,并利用平均光谱进行二阶导,用二阶导数来对17种姜科植物进行属间分类。结果如图3所示。

Fig.3 Cluster analysis of FTIR fingerprint of 17Zingiberaceaeplants

当距离为5时,17个样品分成了7类,黑果山姜、花叶山姜、草豆蔻、红豆蔻、长柄山姜、节鞭山姜、野草果、美山姜、云南草蔻、宽唇山姜聚为一类,顶花莪术、郁金聚为一类,吕氏砂仁、温郁金、印尼莪术、宽丝豆蔻、荽味砂仁各成一类。距离为13时,分成了3类,第一类包括黑果山姜、花叶山姜、草豆蔻、红豆蔻、长柄山姜、节鞭山姜、野草果、美山姜、云南草蔻、宽唇山姜；第二类包括：顶花莪术、郁金、吕氏砂仁、温郁金、印尼莪术；第三类包括：宽丝豆蔻、荽味砂仁。根据中科院植物研究系统中以形态特征对姜科植物的分类来看,黑果山姜、花叶山姜、草豆蔻、红豆蔻、长柄山姜、节鞭山姜、美山姜、云南草蔻、宽唇山姜是山姜属植物；宽丝豆蔻、荽味砂仁、野草果是豆蔻属植物；郁金、印尼莪术、温郁金、顶花莪术是姜黄属植物,吕氏砂仁暂无相关资料说明,待定。同属间的物种亲缘较近,该实验结论支持这种说法,山姜属、豆蔻属、姜黄属在距离13时完全分开,分成了3类,这与传统分类相一致,但也存在一定的差异,如豆蔻属野草果和山姜属聚在了一起。究其本真,这是从光谱特征的角度对姜科植物的分类来提供参考。

3.3 相关分析

相关系数一般在“0-1”之间,两样品间的相关系数越大,表明它们的关系越近[10]。由表可知,每一种姜和其余16种植物分别进行相关性分析,可以得到两两的相关系数,0.980以上的物种间系数从高到低的排列为：花叶山姜和黑果山姜(0.991)、花叶山姜和草豆蔻(0.988)、黑果山姜和野草果(0.987)、黑果山姜和草豆蔻(0.986)、节鞭山姜和长柄山姜(0.985)、长柄山姜和草豆蔻(0.984)、黑果山姜和红豆蔻(0.983)、花叶山姜和红豆蔻(0.981)、美山姜和野草果(0.980)；0.001以下的相关系数有：吕氏砂仁和草豆蔻(0.000)、印尼莪术和长柄山姜(0.000)、吕氏砂仁和红豆蔻(0.001)、美山姜和吕氏砂仁(0.001)、美山姜和印尼莪术(0.001)。相关系数表示距离的远近,和聚类树形图的结果相一致。

Table.3 The correlation coefficient between the 17 Zingiberaceae plants

3.4 品种鉴定

取出待测样品,编号为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、O、P、Q、L、M、N。将此组数据进行9.0平滑、自动基线校正、二阶求导,取1800～1000 cm-1范围内的吸光度,放入已建立起来的模型中进行检测,结果显示如图4。同种物质间的距离系数很小,在距离为1时,A与红豆蔻聚在一起,可以判定A是黑果山姜；B与顶花莪术聚在一起,可以判定B是顶花莪术；依次类推,C是宽丝豆蔻,D是吕氏砂仁,E是荽味砂仁,F是温郁金,G是野草果,H是郁金,I是云南草蔻,J是印尼莪术,K是长柄山姜,O是黑果山姜,P是花叶山姜,Q是节鞭山姜,L是宽唇山姜,M是美山姜,N是草豆蔻。距离系数越小的亲缘关系越近[10],同种物之间的距离系数是最小的,因此,可以利用已建立起来的系统聚类模型来对未知样品的品种进行鉴定。

Fig.4 Clustering result of species identification of 17Zingiberaceaeplants

4 讨论

4.1 姜科植物的亲缘关系分析

聚类分析中,树系图的距离系数越小,表示关系越近；相关性分析中,相关系数越大,表示亲缘越近。结合图3、表3进行讨论：

(1)以形态特征分类的《中国植物志》中,长柄山姜与云南草蔻属于近缘植物。在本实验中,距离为3时,长柄山姜与云南草蔻聚在一起且相关系数为0.882。说明长柄山姜与云南草蔻关系近,这与纳智[11]从挥发油化学分类的角度赞同《中国植物志》“长柄山姜和云南草蔻同属艳山姜亚属且亲缘较近[12]”的结论相符。在距离为1时,长柄山姜与节鞭山姜、红豆蔻、草豆蔻、花果山姜、黑果山姜、美山姜聚在一起且相关系数为0.985、 0.979、0.984、0.978、0.977、0.965,其中距离为1(最小)时,花叶山姜和黑果山姜的相关系数为0.991(最大),关系最近。相关系数在亚属分类的层次上,山姜亚属(红豆蔻、花叶山姜)、艳山姜亚属(云南草蔻、长柄山姜、草豆蔻)、黑果山姜亚属(节鞭山姜、黑果山姜)的亲缘与传统分类有一致性,因此该实验提出同亚属植物大多是近缘植物的观点。

(2)《中国药典》(2005年版)中规定,温郁金块根可用作郁金入药,且有学者根据叶背有无毛建议温郁金继续用曾用名郁金[13]。本实验中,郁金和温郁金在距离为12时才聚在一起且相关系数为0.607(偏低),说明两者差异较大,此结论与刘念等[13]的酶谱研究一样不赞成温郁金为郁金的栽培变种[12]。此外,温郁金与其他药材树系图间的距离较远,相关系数均在0.270以下,其中温郁金与红豆蔻的相关系数为0.005(较低),与美山姜的相关系数为0.01(较低),说明温郁金和不同种类间的遗传差异较大,这支持了陈毓亨等将温郁金划分为独立种[14]的主张。

(3)印尼莪术与温郁金、顶花莪术在远距离处聚在一起,且相关系数为0.263、0.556。说明印尼莪术与温郁金、顶花莪术的亲缘较远。童绍全以印尼莪术部分根茎与块根颜色为黄红色或黄色不同于其它姜黄属莪术类为由,拟名为姜红姜黄[15]。该结论支持了肖小河等[16]数值分类下该种在姜黄属系统分类中的独立性,与杨元庆等[17]将印尼莪术归为一类相一致。结合童绍全、肖小河和杨元庆等的研究结果,该实验支持将印尼莪术划分独立种。印尼莪术中姜黄素类和挥发油的单株产量均较高,具有很好的开发前景。

(4)宽丝豆蔻与荽味砂仁聚在一起且相关系数为0.708,但与同属野草果在树系图上距离很远,相关系数为0.012,这在形态学上,以叶两面无毛,叶柄近圆,叶鞘有纵条纹等特点将宽丝豆蔻、野草果、荽味砂仁归为一个属[12]有差异。同时宽丝豆蔻有叶不被毛、根茎发达等特点,生境和形态都与其它种有一定的差异。表明宽丝豆蔻在种间的遗传差异较大,并提出宽丝豆蔻与荽味砂仁关系近,与其它种植物关系远。

(5)吕氏砂仁在树系图上距离很远时与温郁金聚在一起,且与各物种的相关系数均很小,在0.020以下,有关吕氏砂仁的形态特征、分子生物等方面的研究尚未见报道,根据系统聚类和相关性分析的结果,该实验提出吕氏砂仁可作为一个新种,今后将深入进行这方面的研究。

(6)在距离13时,山姜属、豆蔻属、姜黄属被分成了3类,与传统分类相比,豆蔻属野草果和山姜属聚在了一起,属间分类正确率达到94.1%。距离为1时,野草果与山姜属植物聚在了一起,相关系数均在0.970以上,说明野草果与山姜属植物关系较近。

根据以上的讨论,建议对吕氏砂仁、宽丝豆蔻与野草果作进一步研究,如分子生物学、数值分类和形态显微方面等的深入,再次确定它们的分类情况及地位。期望有多领域的方法和FTIR的深入研究,使得姜科植物的分类系统得到进一步的完善。

4.2 聚类模型在物种鉴定中的应用

系统聚类模型体现了“物以类聚”的思想,对于同种样品间的测定,5份样品聚合都较好。作亲缘分析,亲缘近的物种间距离系数小,同一种物种间距离系数小至为零,因此用傅里叶红外光谱数据建立起的模型来检测未知样品,其正确率达到了100%,其结果可靠、稳定。

5 结论

利用FTIR结合聚类分析法对17种姜科植物进行物种分类与鉴定,其种间的聚类正确率达100%,属间的分类与传统分类有一定的差异,该结果表明：(1)同亚属植物间、野草果与山姜属植物属近缘种；(2)温郁金和印尼莪术各成一类,划分独立种。用FTIR的标准聚类模型来对未知样品进行检测,其正确率达100%。该方法获得的信息量大、速度快、准确率高,说明FTIR结合聚类分析法可以作为姜科植物物种分类及鉴别的可行性手段。

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Application of FTIR Combined with Cluster Analysis in Classification and Identification of Plant Species in the Zingiberaceae Plants

LIU Yan1,SI Ming-zhen2*,LI Jia-wang2,ZHANG Chuan-yun2,ZHANG De-qing2,LI Lun2,XIONG Yang2

(1.SchoolofPhysicsandElectronicInformation,YunnanNormalUniversity,Kunming650500,Yunnan,China;2.YunnanKeyLaboratoryofuniversitiesforMolecularSpectrum,Instituteofspectralappliedtechnology,ChuxiongNormalUniversity,Chuxiong675000,China)

FTIR spectra from 11 kinds ofZingiberaceaeby Fourier transform infrared spectroscopy method combined with the system clustering and correlation coefficient method were used to explore the relationship among the plants.The results show that the cluster analysis is consistent with the results of the correlation analysis,When the distance coefficients ofA.kwangsiensis&LSSR was 1 (minimum),the correlation coefficient was 0.950 (highest),phylogenetic relationships recently; 25 (maximum distance coefficientA.blepharocalyxandC.wenyujin),correlation coefficient of 0.005 (minimum),phylogenetic relationships farthest.The study draws thatA.kwangsiensisand LSSR,C.xanthorrhizaandA.petaloideumare closely related to species,and supported the independence ofC.wenyujinandC.yunnanensisin the classification system,the proposal is divided into separate species.The clustering analysis of the plant species is better,and the correct rate of species identification was 100%.FTIR-cluster analysis can be used as a possible means for the classification and identification ofZingiberaceae.

Fourier transform infrared spectroscopy;Zingiberaceae; correlation coefficient; classification

2015-07-29; 修改稿日期:2016-11-20

国家自然科学基金(13064001,10864001)

刘艳(1990-),女,傈僳族,硕士,主要从事生物光谱学方面研究.E-mail:340596704@qq.com

司民真,E-mail:siminzhen@hotmail.com

1004-5929(2016)03-0252-07

O657.37

A

10.13883/j.issn1004-5929.201603010