毒死蜱降解菌的筛选及降解特性

李珣+尚建超+蓝潇+田学军+沈登荣

摘要：为寻找有机磷农药的快速降解途径，采集污染严重的土样，以毒死蜱为底物，采用梯度驯化法筛选得到菌株CJC-3，并研究该菌株对毒死蜱及其他4种常用有机磷农药（敌敌畏、辛硫磷、乙酰甲胺磷、草甘膦）的降解特性。结果表明，CJC-3对毒死蜱的最佳降解条件：温度为28 ℃，培养时间为48 h，农药浓度为2 000 mg/L，降解率达76.03%。优化CJC-3对其他有机磷农药的降解条件后，降解率分别为敌敌畏50.47%、辛硫磷65.29%、乙酰甲胺磷26.15%、草甘膦36.12%，表明该菌株对有机磷杀虫剂和有机磷除草剂均有一定的降解效果，适用于有机磷农药的普遍降解。

关键词：毒死蜱；有机磷农药；降解菌；降解特性

中图分类号： X592 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0479-03

据报道，2013年我国农药总使用量达到12万t，其中有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类农药使用量分别为86 300、5 800、3 600 t[1]。有机磷类农药已成为三大支柱之一，在世界的农药市场上有着十分重要的地位[2]。其中，毒死蜱是当今有机磷农药中的代表性品种，现在我国约有15%的农药厂家拥有毒死蜱相关产品，按每个品种的平均原药需求量10～15 t 计算，我国约有6 000～9 000 t的原药需求量[3]。农药的使用在带来农业增产、农民增收的同时，农药残留已成为严重危害人类生命健康的主要因素之一，如何消除其对生态环境造成的不良影响就成为了不得不考虑的问题。目前根据国内外的研究，认为微生物降解是解决其残留污染的有效途径[4]，如董庆龙等通过改良定向培育法，驯化筛选到毒死蜱降解菌CAS17，当毒死蜱浓度为100 mg/L 以下时，降解率可达到67%左右[5]。冯发运等从农药厂废液池旁采集小飞蓬植物，提取植物汁液后以毒死蜱作为唯一碳源的无机盐培养基连续筛选，得到1株高效降解菌XFP-gy，当毒死蜱浓度为10 mg/L时，9 d可完全降解毒死蜱，实现无残留[6]。本试验通过驯化、筛选得到毒死蜱降解菌，并探索其降解特性以提高对毒死蜱的降解率，同时还研究了该菌株对其他常用有机磷农药包括杀虫剂和除草剂的降解效果，期望为有机磷农药的广泛修复提供一定参考[7]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样 云南曲靖蔡家冲复合化肥厂周边土壤，采用五点采样法。

1.1.2 培养基 （1）基本培养基：葡萄糖2.5 g、柠檬酸三钠0.5 g、（NH4）2SO4 0.1 g、KH2PO3 3.0 g、K2HPO3 7.0 g、MgSO4 0.1 g、H2O 500 mL、琼脂10.0 g，121 ℃高压蒸气灭菌30 min。（2）无机盐培养基：MgSO4 0.2 g、NH4NO31.0 g、K2HPO30.5 g、CaCl2 0.1 g、KH2PO3 0.5 g、NaCl0.2 g、MnSO4 痕量、FeCl2 痕量、H2O 1000.0 mL，121 ℃高压蒸气灭菌30 min。（3）富集培养基：蛋白胨 10.0 g、氯化钠 5.0 g、牛肉膏 5.0 g、琼脂 20.0 g、H2O 1000.0 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min[8-10]。

1.2 方法

1.2.1 菌种驯化 取5.0 g土样，用含毒死蜱4 mg/L的无机磷培养基于30 ℃、170 r/min条件下振荡培养48 h；取10%转接至新鲜无机磷培养基中并将农药浓度提高1倍，再继续培养48 h；随后加入5 mL含有机磷农药的原液，培养5个周期，共240 h [9-10]。

1.2.2 菌种分离纯化 取100 μL驯化得到的土壤悬浊液涂布于基本培养基表面，经培养后观察，挑取不同形态的菌落，分离纯化。配置毒死蜱浓度为8 mg/mL选择培养基，将分离纯化后的降解菌菌株接种于选择培养基上，保存备用[9-10]。

1.2.3 CJC-3菌株形态特征和主要生理生化特征 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对CJC-3的菌落形态特征及主要生理生化特征进行试验和观察记录[11-12]。

1.2.4 CJC-3对毒死蜱的降解特性研究

分别研究培养时间、温度、毒死蜱浓度、接种量对CJC-3降解的影响因素，以确定其最佳降解条件与最大降解率。设置时间梯度分别是6、12、18、24、36、48、60、72 h；温度梯度分别是25、28、30、35、40 ℃；毒死蜱农药浓度分别是500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L；接种量分别为0.5%、1%、5%、10%、20%。按上述条件将培养管置于恒温摇床中170 r/min培养，得出最佳降解条件，利用钼锑抗法测定复合菌剂的降解率[9-10，13]。

1.2.5 CJC-3对其他常用有机磷农药的降解特性研究

分别设置培养时间24、36、48、60、72 h；培养温度20、24、28、32、36 ℃；敌敌畏浓度20、40、60、80、160、240、320、400、480 mg/L；辛硫磷浓度100、140、180、220、260、300、340、380 mg/L；乙酰甲胺磷浓度60、120、180、240、300、360、420、480、540 mg/L；草甘膦浓度40、80、120、160、200、240、280、320 mg/L。将培养管置于恒温摇床中170 r/min培养，测定降解效率，得出最佳降解条件[7，10，13]。

2 结果与分析

2.1 降解菌的分离纯化

经过分离、纯化得到1株高效降解菌，编号为CJC-3。

2.2 CJC-3菌株形态特征和主要生理生化特征

经初步生理生化鉴定后，CJC-3于选择培养基上的单菌落呈圆形，表面光滑湿润，菌体隆起，边缘整齐不透明。初生时为白色，生长时间较长后为乳白色，菌体挑取时有黏着性，划线时不易划开，菌体常多个连在一起，呈短杆状，菌体平均直径为4.70 μm，革兰氏反应呈阳性，存在芽孢和荚膜，为好氧菌。

2.3 CJC-3菌株对毒死蜱的降解特性

2.3.1 毒死蜱降解时间优化

如图1所示，当降解时间较短时，CJC-3菌株数量少、生长缓慢，菌株降解活性低，随着降解时间的延长，菌体利用培养基的营养成分大量繁殖，CJC-3菌株对于毒死蜱的降解能力也逐渐增强、降解率明显上升，于48 h时降解率达到最大；在48 h后，可能由于营养成分的消耗、降解后的有机磷被菌体重新利用、菌体老化等原因，降解率呈现下降趋势，当培养时间为48 h时，降解率最高，为57.01%。

2.3.2 毒死蜱降解温度优化

如图2所示，CJC-3降解菌株在低温和高温时降解率低至18.90%，分析可能因高温和低温环境下抑制酶活性，不能有效地降解毒死蜱，在温度为28 ℃时降解率最高，温度达30 ℃时降解率骤降。最终温度优化试验结果显示：当降解温度为28 ℃时，降解率最高，为58.80%。

2.3.3 毒死蜱浓度优化 如图3所示，低浓度毒死蜱培养时，CJC-3降解菌株菌体降解能力弱，当毒死蜱浓度自500 mg/L 逐渐上升至2 000 mg/L时，降解率达到最高，当毒死蜱浓度再升高时，降解率下降，毒死蜱浓度优化试验结果：CJC-3降解菌株在毒死蜱浓度为2 000 mg/L时，降解率最高，为65.85%。

2.3.4 降解菌最佳接种量 如图4所示，CJC-3降解菌株接种量为0.5%～5%时降解率迅速提升，接种量至5%后，继续增加接种量降解率提升效率变化不明显，因此最适接种量为5%。

综合上述最优条件，在温度28 ℃、培养时间48 h、农药浓度为2 000 mg/L、接种量为5%（D600 nm=1）的条件下，CJC-3菌株的降解率最高值可达到76.03%。

2.4 CJC-3对其他常用有机磷农药的降解特性

2.4.1 有机磷农药浓度对CJC-3降解效果的影响

设置敌敌畏浓度分别是20、40、60、80、160、240、320、400、480 mg/L。如图5所示，敌敌畏浓度在80 mg/L时CJC-3菌株降解敌敌畏效果最好，降解率为42.72%。

如图6所示，辛硫磷浓度在260 mg/L时CJC-3菌株对辛硫磷的降解最好，为39.54%。

如图7所示，乙酰甲胺磷浓度在240 mg/L时CJC-3菌株对乙酰甲胺磷的降解率最佳，为24.15%。

如图8所示，草甘膦浓度在120 mg/L时CJC-3菌株对草甘膦的降解效果最佳，为15.32%。

综合上述，农药浓度对CJC-3菌株降解效果有显著的影响。CJC-3菌株对这4种农药的降解率，随着农药浓度的升高降解率逐渐升高，当农药浓度达到最适浓度时，降解率达到最大，最后随着农药浓度升高而逐渐减小。当农药浓度超过菌体所能承受的浓度后，菌体逐渐裂解死亡，降解率逐渐减小。

2.4.2 温度对CJC-3降解效果的影响

每种有机磷农药分别设置了5个温度梯度：20、24、28、32、36 ℃，通过测定培养温度对CJC-3菌株降解4种有机磷农药的降解率变化和影响，如图9所示。

CJC-3菌株在4种有机磷农药中表现一致，在20～28 ℃ 之间随着温度升高而逐渐增大。在28 ℃时达到最大，在28～36 ℃之间随着温度升高而降低。在28 ℃下，4种农药降解率分别为：草甘膦36.12%、敌敌畏41.54%、辛硫磷50.95%、乙酰甲胺磷26.15%。

2.4.3 培养时间对CJC-3降解效果的影响

分别测定4种有机磷农药条件下，培养时间对CJC-3降解效果的影响。试验结果表明，CJC-3菌株对草甘膦、敌敌畏、乙酰甲胺磷的降解率，随着培养时间的增加降解率逐渐增大。在48 h降解率达到最大，分别为：草甘膦35.21%、敌敌畏50.47%、乙酰甲胺磷23.4%，之后随着培养时间的增加降解率逐渐减小，辛硫磷在60 h降解率达到最大，为65.29%（图10）。

3 结论与讨论

以毒死蜱为底物，采用梯度驯化法筛选得到菌株CJC-3。通过降解特性研究，CJC-3对毒死蜱的最佳降解条件为：温度28 ℃、培养时间48 h、农药浓度为2 000 mg/L，降解率达76.03%。然而，在实际农业生产中，为保证有效防治有害生物，常常施用多种农药。为更好地发挥CJC-3降解菌的广泛应用性，试验还研究了CJC-3对敌敌畏、辛硫磷、乙酰甲胺磷3种有机磷杀虫剂以及1种有机磷除草剂草甘膦的降解特性。结果表明，CJC-3菌株对4种农药的降解率从大到小依次为：辛硫磷65.29%、敌敌畏50.47%、草甘膦36.12%、乙酰甲胺磷24.15%，证明该菌株对有机磷农药具有广泛的降解特性，除可降解有机磷杀虫剂外，对有机磷除草剂也有一定降解作用，可作为农药残留控制的新途径，为修复有机磷农药污染的土壤提供了有效参考。

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