菌酶共降解棉秸秆的工艺研究

侯敏，包慧芳，王宁，詹发强，杨蓉，龙宣杞，崔卫东

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091)



菌酶共降解棉秸秆的工艺研究

侯敏，包慧芳，王宁，詹发强，杨蓉，龙宣杞，崔卫东

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091)

【目的】研究菌酶共降解棉秸秆工艺，为菌酶混合棉秸秆固体发酵的研究提供相应的工艺参数和理论依据。【方法】根据羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活确定最佳混菌组，采用正交试验，研究不同混菌组、酶制剂、含水量对NDF含量、ADF含量、纤维素含量、纤维素降解率的影响，并且通过感官评价、pH值及干物质含量确定发酵棉秆品质。【结果】发酵最优条件为A1B2C2，即混菌组为Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1，酶活为15 000 U/g，加水量为50%。最优发酵条件下，NDF含量降低4.61%，ADF含量降低8.01%，纤维素含量降低10.74%，纤维素降解率达25.62%，pH值为4.21，干物质含量为54.2%，棉秆品质为优等。【结论】菌酶混合发酵棉秸秆提高棉秆品质的最佳条件。

棉秆；混菌；酶；固体发酵；棉秆品质

0 引 言

【研究意义】新疆是我国畜牧业主产区之一[1]，饲草料极为短缺，年缺口超过1 300×104t，严重制约畜牧业发展。新疆棉花种植面积约占全国的1/3，棉秆资源相当丰富，年产量达1 000×104t以上。新疆棉花秸秆中粗蛋白的含量为6.5%，比玉米秸秆、稻草和小麦秸秆的粗蛋白含量都要高[2]。因此，棉花秸秆具备制作优质饲草料的基础。纤维素是棉秆的主要成分，与半纤维素、木质素通过分子间氢键形成一种复杂的原纤维结构[3]，降低棉秆中纤维素是解决棉秸秆饲料化的重中之重。【前人研究进展】目前，秸秆预处理方法主要包括生物法、物理法、化学法、物理化学法[4]。广泛地开展了降解纤维素微生物菌株的研究[5-6]，并且利用纤维素酶制剂提高青贮饲料的营养价值[7-9]。赵政等[10]利用乳酸菌制剂和纤维素酶制剂的添加可以使青贮稻草饲料品质得到明显改善；在玉米秸秆青贮过程中添加乳酸菌和纤维素酶，可有效降低青贮饲料腐败率、改善和提高青贮饲料的品质及营养价值[11]；乳酸菌和纤维素酶的共同作用可以使玉米秸秆青贮饲料中NDF，ADF分别降低10%和7%[12]。【本研究切入点】近年来，运用微生物发酵处理棉秆，主要应用于生物肥料，并且利用菌酶混合发酵棉秆饲料的研究还未报道。研究菌酶共降解棉秸杆工艺，确立菌酶混合发酵棉秸秆提高品质的最佳条件。【拟解决的关键问题】研究纤维素酶和乳酸菌、芽孢杆菌对棉秸秆饲料品质的影响，为菌酶混合制剂在棉秆饲料中的研究和应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 棉秆

新疆中收农牧机械公司提供，棉秆处理成1～2 cm片段。

1.1.2 菌种

LP+为植物乳酸菌(lactobacillusplantarum)，TH14为干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，295为布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)，WS-6为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，BS-2为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

1.1.3 酸性纤维素酶

购于山东苏柯汉生物工程股份有限公司，酶活≥10 000 U/g；购于山东苏柯汉生物工程股份有限公司，酶活≥15 000 U/g；日本国立畜产草地研究所提供，酶活≥20 000 U/g；酶活定义：1个酶活力单位是指在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，在1 min内能转化1 μmol微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1 μmol的有关基团的酶量。

1.1.4 培养基

LB培养基：蛋白栋 10 g、酵母粉 5 g、氯化钠10 g、水 1 000 mL、pH 7.0。

MRS培养基：蛋白胨 10.0 g 、牛肉浸取物 10.0 g、酵母提取液 5.0 g、 葡萄糖 5.0 g、乙酸钠 5.0 g、柠檬酸二铵 2.0 g、吐温 80 1.0 g、磷酸氢二钾 2.0 g、 七水硫酸镁 0.2 g、七水硫酸锰 0.05 g、碳酸钙 20.0 g、琼脂 20.0 g、蒸馏水 1.0 L，pH6.8。

复筛培养基：硝酸钠 0.5 g、滤纸(需预处理)5.0 g、氯化钾 0.5 g、氯化钙0.5 mg、磷酸氢二钾 1.0 g、硫酸铜 5.0 mg、七水硫酸亚铁 5.0 mg、七水硫酸镁 0.5 g、蒸馏水 1 000 mL，pH 6.0，在121℃、101 kpa下灭菌20 min。

滤纸的预处理方法：将新华1号滤纸用1%的醋酸溶液里浸泡24 h除去淀粉；用碘液检验淀粉后，再用2%的碳酸氢钠溶液洗至中性，然后晒干备用。

1.2 方 法

1.2.1 液体种子的制备

芽孢杆菌经斜面活化后刮取一环接入 200 mL 液体 LB 培养基，在 30℃，120 r/min 条件下摇瓶培养 12 h，制成种子液；乳酸菌经斜面活化后刮取一环接入 200 mL 液体 MRS培养基，在 30 ℃，120 r/min 条件下摇瓶培养18 h，制成种子液。

1.2.2 混菌组的确定

以1%的接种量接种于纤维素分解菌复筛液体培养基，35℃、120 r/min下摇床培养16 d后测定羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活。Lp+、TH14、295、WS-6和BS-2五种菌的混合配比实验设计。表1

表1 混菌混合配比
Table 1 The design of mix strain rate

混菌组MixedBacteriaGroupLp+TH14295WS-6BS-2①111--②11-1-③11--1④1111-⑤111-1⑥11-11

1.2.3 正交试验设计

根据实际发酵确定关键因素，不同酶活、不同含水量、不同混菌组进行正交试验，1%的菌液添加量，60 d固体瓶装发酵实验，研究酶制剂、含水量及混菌对棉秆中纤维素降解率的影响。选用3因素3水平L9(33) 正交表试验，进一步优化，采用正交软件助手对正交试验结果进行方差分析。其中，混菌组根据确定好的配比分别为组、组、组；酶制剂酶活分别为10 000、15 000和20 000 U/g；含水量分别为40%、50%、60%。每个处理3次重复。对照组为未处理棉秆。表2

表2 正交试验因素水平
Table 2 The orthogonal experiment factor levels

水平LevelA混菌组MixedBacteriaGroupB酶活(U/g)EnzymeActivityC含水量(%)Moisture1?10000402?15000503?2000060

1.2.4 测定项目

1.2.4.1 棉秆发酵饲料化学成分含量测定含量测定

发酵棉杆中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素含量采用范式(Van Soest)纤维测定法[13]。

1.2.4.2 pH的测定

取 5.0 g鲜样品，加入45.0 mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌1 min后使用酸度计立刻测定pH值。

1.2.4.3 干物质的测定

称取50.0 g样品，放置于105℃的烘箱中3 h左右烘干至恒重，冷却后称重。

1.2.4.4 棉秆固体发酵评价

感官评价按照德国农业协会[14](DLG)感官评分标准对气味、结构、颜色、总分等级进行评定。

2 结果与分析

2.1 混菌组确定的

研究表明，六组混菌：①Lp+∶TH14∶295=1∶1∶1、②Lp+∶TH14∶WS-6=1∶1∶1、③Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1、④Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1、⑤Lp+∶TH14∶295∶WS-6=1∶1∶1∶1、⑥ Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1，1%的接种量、35℃、120 r/min下摇床培养16 d后测定羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活。其中③Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1滤纸酶活19.654 U/L、羧甲基纤维素钠酶活20.785 U/L，酶活在各组中最高；另外，⑤Lp+∶TH14∶295∶WS-6=1∶1∶1∶1滤纸酶活16.443 U/L、羧甲基纤维素钠酶活18.524 U/L；⑥ Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1滤纸酶活18.741 U/L、羧甲基纤维素钠酶活19.953 U/L。表3

2.2 正交优化试验

根据不同混菌组的羧甲基纤维素酶活、滤纸酶活的研究表明，确定三组混菌组：组①：Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1、组②：Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1、组③：Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1；酶制剂酶活分别为10 000、15 000、20 000 U/g；含水量分别为40%、50%、60%。设计三因素三水平正交实验，结果表明，极差列中混菌组因素的极差值最大，不同的混菌组对纤维素降解率的影响最大，其次是酶活、含水量。发酵最优条件为A1B2C2，即混菌组为Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1，酶活为15 000 U/g，加水量为50%。对照未处理的棉秆NDF含量为63.43%，ADF含量为58.12%，纤维素含量为41.92%。经过固体发酵，NDF含量降低3.44%～4.61%，ADF含量降低4.14%～8.01%，纤维素含量降低4.72%～10.74%。最优发酵条件下，纤维素降解率达25.62%。表4

表3 混菌混合配比结果
Table 3 The results of Mixed fungus mix ratio test

实验组ExperimentalGroup滤纸酶活(U/L)FilterPaperEnzymeActivity羧甲基纤维素钠酶活(U/L)SodiumCarboxymethylCelluloseEnzymeActivity①1141314524②1611816706③1965420785④1583217155⑤1644318524⑥1874119953

表4 发酵培养基优化正交试验
Table 4 The results from the orthogonal test for optimized composition of the ferment medium

实验组ExperimEntalGroupA混菌组MixedBacteriaGroupB酶活(U/g)EnzymeActivityC含水量(%)MoistureNDF(%)ADF(%)Cellulose(%)纤维素降解率(%)CelluloseDegradationRate1?200004059095011315924642?150005059075024311825623?100006059005111318224094?200004059225134333020565?150005058825074330221236?100006059065121353515677?200004058965293354015568?150005058885259342318349?10000605990539837201126K1247820251955----K2191521731915----K3150517012029----R973472115----

2.3 棉秆发酵饲料的感官评定、pH及干物质的测定

研究表明，经过微生物发酵处理的棉秆在气味上评分11～13、结构上评分均为4、颜色上评分1～2、总分16～20，等级均为优等。对照CK，气味上评分8、结构上评分均为4、颜色上评分1、总分13，等级尚好。表5

表5 棉秆发酵饲料感官评分
Table 5 The standards of Cotton fermented feed sensory score

样品TheSample气味Smell结构Structure颜色Color总分TotalScore等级Grade1134217优等2144220优等3134219优等4114217优等5114217优等6114116优等7114116优等8114116优等9114116优等CK84113尚好

棉秆微贮处理后的pH值表明。对照CK未处理棉杆pH值最高，为4.97；经过微生物发酵的棉杆处理均比对照低，pH在4.21～4.56；其中，实验组2的pH值最低，为4.21。图1

图1 棉杆发酵饲料pH值
Fig.1 pH value of fermented cotton feed

研究表明，经微贮后的棉秆发酵饲料干物质含量测定结果显示。对照CK未处理棉杆干物质含量最低，为12.2%；经过微生物发酵的棉杆处理均比对照高，干物质含量在26.4%～54.2%；其中，实验组2的干物质含量最高，为54.2%。图2

图2 棉杆发酵饲料干物质含量测定结果
Fig.2 Dry matter content determination results of fermented cotton feed

3 讨 论

3.1 作物青贮时接种同型乳酸菌(主要为粪链球菌、啤酒片球菌、植物乳杆菌、干酷乳杆菌)，可以迅速增加农作物表面的乳酸菌数目，使乳酸发酵占主导地位，从而达到降低pH值，抑制有害微生物的活动，保存和提高饲料营养价值的目的[12]。微生物固体发酵过程中加入芽孢杆菌等，其本身就是益生菌，有利于改善动物胃肠道的微生态环境，减少抗生素的应用和疾病的发生[15-16]。加入酶制剂能够降低粗饲料中的纤维素、半纤维素、淀粉等，解决秸秆类饲料中粗纤维含量过高的问题，从而促进乳酸发酵，提高饲料利用率。实验采用芽孢杆菌、植物乳酸菌及酸性纤维素酶的菌酶复合制剂发酵棉秆，可有效降低棉秆饲料腐败率、改善和提高青贮饲料的品质。

3.2 对于青贮饲料，对其发酵品质的评估很重要,这包括测定青贮饲料的pH值、各种挥发性脂肪酸、乳酸的含量、青贮的损失、氨态氮/总氮、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、木质素、可溶性碳水化合物(WSC)的含量[17]。原料适宜的水分是保证青贮过程中乳酸菌正常活动的重要条件之一，水分过多，容易腐烂，渗出液多，养分损失大；水分过低，会直接抑制微生物发酵，且由于空气难以排净，易引起霉变[18]。pH是评价微贮和青贮饲料品质最简单且最重要的指标，

pH值越低，酸度越大，则说明饲料得到了很好的保存[19]，品质优良的青贮饲料pH为3.8～4.5[12]。实验考察不同混菌组、酶制剂、含水量对NDF含量、ADF含量、纤维素含量、纤维素降解率的影响，并且通过感官评价、pH值及干物质含量确定发酵棉秆品质。

4 结 论

4.1 设计六组混菌，确定最优化酶活产量。其中，③ Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1滤纸酶活19.654 U/L、羧甲基纤维素钠酶活20.785 U/L，酶活在各组中最高；另外，⑤Lp+∶TH14∶295∶WS-6=1∶1∶1∶1滤纸酶活16.443 U/L、羧甲基纤维素钠酶活18.524 U/L；⑥ Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1滤纸酶活18.741 U/L、羧甲基纤维素钠酶活19.953 U/L。根据测定羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活结果，挑选③、⑤、⑥三组产酶活较高的混菌组进行下一步正交试验。

4.2 根据实际应用，设计不同酶活、不同含水量、不同混菌组三因素三水平正交试验，以NDF含量、ADF含量、纤维素含量、纤维素降解率为指标，确定最佳发酵条件。发酵最优条件为A1B2C2，即混菌组为Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1，酶活为15 000 U/g，加水量为50%。最优发酵条件下，NDF含量降低4.61%，ADF含量降低8.01%，纤维素含量降低10.74%。纤维素降解率达25.62%。

4.3 对发酵棉秆进行感官评定，并且测定pH值及干物质含量。经过微生物发酵处理的棉秆在气味上评分11～13、结构上评分均为4、颜色上评分1～2、总分16～20，等级均为优等；pH值在4.21～4.56；其中，实验组2的pH值最低，为4.21；干物质含量在26.4%～54.2%；其中，实验组2的干物质含量最高，为54.2%。

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Fund project:Xinjiang Uygur Autonomous Region Fund for Young Scholars "Screening and Breeding of Highly-Effected Degrading Lignocellulose Strains and Degradation Effect Research" (2015211B019)；the Basic Science and Technology Research Support Funds of Non-profit Research Institutions of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Microbial Treatment Technology of Cotton Stalks" (KY2014028)

Technology for Co-degradation of Cotton Stalk by Microorganism and Enzyme

HOU Min, BAO Hui-fang, WANG Ning, ZHANG Fa-qiang, YANG Rong,LONG Xuan-qi, CUI Wei-dong

(Research Institute of Applied Microbiology / Xinjiang Academy of Agricultural Sciences / Xinjiang LaboratoryofSpecialEnvironmentalMicrobiology,Urumqi830091,China)

【Objective】 The co-degradation technology of cotton stalk by microorganism and enzyme will be studied.【Method】ccording to the carboxymethyl cellulose enzyme activity and filter paper enzyme activity, the best mixed bacterium group was determined and by orthogonal experiment, the different mixed bacteria group, enzyme preparation, contents of moisture content of NDF, ADF, cellulose, cellulose degradation rate and the effect were observed and through the sensory evaluation, pH value and dry matter content, the fermentation quality of cotton was determined.【Result】The results showed that the fermentation conditions was as follows (g/L): mixed bacterium group for Lp+:TH14: 295: BS-2=1:1:1:1, the enzyme activity of 15 000 U/g, water content of 50%. Under the optimal fermentation conditions, the NDF content was reduced by 4.61%, ADF content was reduced by 8.01%, cellulose content was reduced by 10.74%, cellulose degradation rate was 25.62%, and the pH value was 4.21, dry matter content was 54.2%, the cotton quality was superior.【Conclusion】This experiment determined the best conditions to increase the quality of cotton, and the results can be used as technical parameters and theoretic basis for decreasing the degradation rate with mixture microorganism and enzyme strain on cotton stalks.

cotton; mixed bacteria; enzyme; solid-state fermentation; the quality of cotton

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.014

2016-04-25

新疆维吾尔自治区青年基金项目“木质纤维素降解菌株选育及混菌发酵在棉秆饲料中降解效果研究”(2015211B019)；自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目“棉秸秆饲料化微生物处理技术研究”(KY2014028)

侯敏(1983-)，女，新疆人，助理研究员，研究方向为农业微生物及发酵工程，(E-mail)hmde_092@ 163.com

崔卫东(1969-)，男，新疆人，研究员，研究方向为发酵工程，(E-mail)cuwedo@163.com

S182

A

1001-4330(2016)08-1467-07