定坤丹对多囊卵巢模型大鼠生殖功能的影响

宋玉荣，王文艳，卫 兵



定坤丹对多囊卵巢模型大鼠生殖功能的影响

宋玉荣，王文艳，卫 兵

目的 研究定坤丹对多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠生殖功能的影响。方法 采用丙酸睾酮注射液联合绒促性腺素造模法建立PCOS模型，比较给药前后大鼠卵巢形态学、性激素水平、卵巢中血管内皮生长因子(VEGF)及子宫内膜同源框基因A10(HOXA10)表达情况。结果 与模型组大鼠比较，定坤丹组卵巢内黄体数增加，血清促黄体生成素(LH)与雄激素(T)下降，卵泡刺激素(FSH)上升，卵巢VEGF表达下降，子宫HOXA10基因表达上升，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 定坤丹对PCOS模型大鼠具有促排卵、提高子宫内膜容受性作用。其机制可能与调节多囊卵巢模型大鼠体内性激素水平、减少卵巢中VEGF表达、增加子宫HOXA10表达有关。

多囊卵巢综合征；定坤丹；血管内皮生长因子；同源框基因A10

多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome，PCOS)是妇科常见生殖内分泌代谢紊乱的疾病之一。PCOS是一种雄激素过多、伴有慢性无排卵和多囊卵巢形态等一系列变化的生殖内分泌紊乱疾病[1]。目前PCOS病因及发病机制不明确，发病机制可能与代谢、胰岛素抵抗、免疫反应及炎症、血管生成学说等相关。临床常表现为月经稀发、多毛、痤疮、不孕等症状。治疗方式以药物为主，常用药物副作用大、复发率高，因此需寻求副作用小及疗效确切的药物。定坤丹具有滋补气血、活血化瘀、理气疏郁的功效。目前定坤丹对治疗PCOS尚无文献报道。该研究以卵巢形态学、性激素、卵巢血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、子宫内膜同源框基因A10(homeoboxgeneA10，HOXA10)为研究指标，研究定坤丹对多囊卵巢模型大鼠的内分泌调控及促排卵、子宫内膜容受性方面的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 定坤丹(山西广誉国药有限公司)；枸橼酸氯米芬胶囊(上海衡山药业有限公司)；丙酸睾酮注射液(天津金耀药业有限公司)；绒促性腺素(丽珠集团丽珠制药厂)；卵泡刺激素(folliclestimulatinghormone,FSH)、促黄体生成素(luteinizinghormone,LH)、睾酮(androgen,T)(武汉华美生物有限公司)；HOXA10抗体(美国Abcam公司)；VEGF抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.1.2 动物 21dSPF级雌性SD乳鼠61只，50～60g，由安徽医科大学动物实验中心提供，乳鼠饲养于安徽医科大学动物实验室，室内温度25 ℃，颗粒饲料常规饲养，饮用自来水。

1.2 方法

1.2.1 多囊卵巢大鼠模型建立 根据Belooseskyetal[2]造模方法建立模型，50只大鼠于23日龄起颈背部皮下注射丙酸睾酮(1.25mg/只，1次/d)及绒促性腺素(1.5IU/只，2次/d)，持续5周。另外11只为正常组，同期皮下注射食用橄榄油(0.05ml，1次/d)及生理盐水(0.1ml/只，2次/d)，持续5 周。期间大鼠每周测体重1次，造模最后10d，大鼠每日行阴道涂片检查。

1.2.2 模型检测与纳入标准 阴道涂片提示建立模型的50只大鼠中有43只动情周期失去规律性变化，镜下见大量持续角化细胞，正常组11只仍保持规律的动情周期。从失去动情周期43只大鼠中随机选取10只处死，处死后取卵巢，显示卵巢体积增大，表面见囊状扩张明显的卵泡，4%甲醛固定12h后行HE染色，镜下观察显示大鼠卵泡膜层增厚，颗粒细胞层数减少，卵巢间质细胞增生明显，其下有较多早期发育的小卵泡与闭锁卵泡，卵泡囊状扩张明显，提示模型复制成功。

1.2.3 实验分组及给药 结合阴道涂片及卵巢HE染色确定造模成功，43只大鼠中剩下的33只大鼠随机分为3组，模型对照组、定坤丹组、克罗米芬组。根据《实验动物学》药物剂量，定坤丹组2.20g/(kg·d)，克罗米芬组5mg/(kg·d)，模型对照组、正常组每只给予等量蒸馏水灌胃，每日1次，共3周，期间正常组1只因灌胃操作不规范死亡。

1.3 指标检测与方法 给药期间每周大鼠测体重1次，比较大鼠用药前后体重。用药3周后摘取卵巢及子宫，比较卵巢体重。取腹主动脉血行血清学检测，HE染色，镜下观察卵巢形态；免疫组化检测卵巢VEGF及子宫内膜HOXA10基因表达。

1.3.1ELISA法检测大鼠血清中性激素 末次给药后禁食过夜，次日2%戊巴比妥钠(0.2ml/100g)腹腔麻醉后打开腹腔取腹主动脉血，血液收集于1.5mlEP管中，静置2h，分离血清(2 000r/min、15min)，将血清置于-20 ℃冰箱保存。根据ELISA说明书测T、LH、FSH，用酶标仪测定光密度(opticaldensity,OD)值，绘制标准曲线，通过标准曲线测浓度。

1.3.2HE染色 取卵巢及子宫，卵巢称重，4%甲醛固定，卵巢固定12h，脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、HE染色、中性塑胶封片，光学显微镜观察卵巢形态。

1.3.3 免疫组化检测 卵巢及子宫固定12h，脱水、包埋、切片分别按照山羊超敏二步法及通用型二步法检测试剂盒操作说明操作。免疫组化二步法测定VEGF在大鼠卵巢组织中的表达及HOXA10在子宫内膜组织中的表达，每个样本随机选取5个不重叠高倍镜(40×10)视野进行观察拍照，采用ImageProplus软件分析图像，对所有切片中阳性区域的单位OD值进行定量分析，测定VEGF及HOXA10的平均OD值，反应卵巢组织中VEGF及子宫组织中HOXA10基因表达水平。

2 结果

2.1 4组大鼠体重比较 4组大鼠体重差异有统计学意义(F=16.46，P<0.01)。模型对照组大鼠较正常组体重增长，差异有统计学意义(P<0.05)。定坤丹组与克罗米芬组大鼠较模型组大鼠体重减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。定坤丹组体重减轻明显，与克罗米芬组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 4组大鼠卵巢体重比较 4组大鼠卵巢体重差异有统计学意义(F=18.56，P<0.01)。与正常组比较，模型对照组卵巢重量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，定坤丹组卵巢重量减轻，差异有统计学意义(P<0.05)，克罗米芬组重量下降，差异无统计学意义。与克罗米芬组比较，定坤丹组卵巢重量减轻，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠体重和卵巢重量比较±s)

与正常组比较：*P<0.05;与模型对照组比较：#P<0.05

2.3 4组大鼠性激素比较 4组大鼠血清LH、FSH、T浓度差异有统计学意义(F=32.47、15.49、7.36，P<0.01)。与正常组比较，模型对照组LH、T升高、FSH下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，定坤丹组LH及T下降、FSH升高，差异有统计学意义(P<0.05)；克罗米芬组LH下降、FSH升高，差异有统计学意义(P<0.05)，T浓度差异无统计学意义。与克罗米芬组比较，定坤丹组LH、T下降，差异有统计学意义(P<0.05)，FSH浓度差异无统计学意义，见表2。

表2 各组大鼠LH、FSH、T比较

与正常组比较：*P<0.05；与模型对照组比较：#P<0.05

2.4 卵巢镜下形态观察 镜下观察：正常组见颗粒细胞多层，见多个黄体；模型对照组见颗粒细胞层数减少，卵泡囊状扩张明显，卵泡膜细胞层及白膜增厚，未见黄体；定坤丹组及克罗米芬组颗粒细胞层数增多，白膜及卵泡膜细胞层较模型组变薄，黄体数目增多，见图1。

2.5 模型对照组卵巢大体形态 模型对照组大鼠卵巢重量增加，体积增大明显，部分水肿，卵巢表面见多个透明扩张的卵泡，见图2。

2.6 免疫组化二步法检测结果VEGF表达的阳性信号为浅棕色至深棕色颗粒，卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞及间质细胞均有表达。半定量实验结果：4组大鼠卵巢组织VEGF表达差异有统计学意义(F=17.54，P<0.05)。与正常组比较，模型对照组VEGF表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，定坤丹组VEGF表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，克罗米芬组VEGF表达差异无统计学意义。与正常组比较，定坤丹组VEGF表达差异无统计学意义，见图3、表3。

图1 各组大鼠卵巢形态学 HE×400

：正常组；B：模型对照组；C：定坤丹组；D：克罗米芬组

图2 模型对照组大鼠卵巢大体形态

图3 各组大鼠卵巢组织中VEGF的表达 免疫组化×400

：正常组；B：模型对照组；C：定坤丹组；D：克罗米芬组

2.7 免疫组化二步法检测HOXA10基因表达HOXA10基因表达信号为浅棕色至深棕色颗粒，子宫内膜腺上皮、腔上皮细胞质，间质细胞核及细胞质均有表达。半定量分析结果：4组大鼠子宫内膜HOXA10基因表达差异有统计学意义(F=11.21，P<0.05)。与正常组比较，模型对照组大鼠子宫HOXA10表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，定坤丹组HOXA10表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)，克罗米芬组表达差异无统计学意义。与正常组比较，定坤丹组HOXA10表达差异无统计学意义，见图4、表3。

图4 各组大鼠子宫内膜HOXA10

：正常组；B：模型对照组；C：定坤丹组；D：克罗米芬组

表3 各组大鼠卵巢VEGF及子宫HOXA10基因平均OD值

与正常组比较：*P<0.05：与模型对照组比较：#P<0.05

3 讨论

PCOS是孕龄期妇女月经紊乱常见的一种疾病，同时也是不孕症的主要原因之一，我国孕龄妇女患病率约为5%～10%，占无排卵性不孕症的75%[3]，目前病因、机制复杂，不明确，临床表现呈多态性，治疗困难。其发病机制可能为下丘脑-垂体-卵巢轴失调、胰岛素抵抗、肾上腺功能异常，生长激素、类胰岛素样生长因子及受体、结合蛋白等分泌失常有关[4]。研究[5]表明PCOS发病与血管生成有关，VEGF被认为可能参与了PCOS的发病。VEGF是一种多功能的生长因子，可以促进血管内皮有丝分裂，促进新生血管形成，增加血管通透性。PCOS患者体内VEGF过多导致卵巢内膜和间质增生及血管增多，卵巢血管生成异常导致不排卵。Abramovichetal[5]发现下调VEGF的表达可促进卵泡的排卵和发育。本次实验结果显示定坤丹降低卵巢中VEGF含量，与模型对照组比较差异有统计学意义。

PCOS患者存在妊娠率低、流产率高，研究[6]显示主要原因之一是子宫内膜容受性低。子宫内膜容受性是指母体子宫内膜处于一种允许胚泡黏附、穿透并植入的状态[7]。PCOS妊娠率低的原之一是胚泡着床障碍，而子宫内膜容受性低是阻碍胚泡着床的主要因素之一。HOXA10是目前公认的PCOS子宫内膜相关基因，HOXA10是一种多效性转录因子，参与胚胎种植的各个环节，具有控制胚胎发育和调节细胞分化的作用，如子宫内膜的增殖与分化、子宫内膜容受性建立、胚胎定位、黏附及胞饮突形成、蜕膜化等，是胚胎着床和成功妊娠所必须的。无排卵患者子宫内膜HOXA10表达普遍低于正常者。HOXA10表达受多种因素影响，雌孕激素上调HOXA10表达,睾酮阻断HOXA10表达。体外研究[8]表明, 雄激素可直接降低子宫内膜HOXA10的表达, 提示降低雄激素可能有助于改善子宫内膜的容受性。此次实验数据可以看出，与正常组比较，模型对照组雄激素高、HOXA10基因表达低，差异有统计学意义。定坤丹能显著降低血清雄激素，提高子宫内膜HOXA10表达，与模型对照组比较差异有统计学意义。

目前PCOS主要治疗方法是药物治疗，药物治疗目的是调整月经周期及促排卵。促排卵常用的一线药物克罗米芬，具有高排卵、低怀孕率特点，且20%～25%患者对克罗米芬无反应[9]。克罗米芬干扰体内激素分泌，子宫内膜容受性低是其低妊娠率原因之一。本次实验结果显示与模型对照组比较，克罗米芬组子宫内膜HOXA10表达差异无统计学意义，即无提高子宫内膜容受性作用。中医认为PCOS基本机制为肾虚血瘀。定坤丹具有调补肝肾、益气养血、暖宫功效，主要用于不孕症及月经不调的治疗。与模型对照组比较，定坤丹组大鼠体重及卵巢重量减轻，大鼠卵巢内卵泡成熟，黄体数增加。定坤丹对于多囊卵巢模型大鼠有促排卵作用，其机制可能通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴，降低黄体生成素及雄激素，升高卵泡刺激素，抑制卵巢VEGF表达,抑制卵巢新生血管形成，改善卵巢血流，提高卵泡质量，促进卵巢排卵。定坤丹具有提高子宫内膜容受性作用，机制可能与改善大鼠体内激素分泌、降低雄激素、上调HOXA10表达有关。本次实验为临床使用定坤丹治疗PCOS提供了一定的实验依据。

[1]Turner-McGrievyGM,DavidsonCR,WingardEE,etal.Lowglycemicindexveganorlow-calorieweightlossdietsforwomenwithpolycysticovarysyndrome:arandomizedcontrolledfeasibilitystudy[J].NutrRes,2014,34(6):552-8.

[2]BelooseskyR,GoldR,AlmogB,etal.Inductionofpolycysticovarybytestosteroneinimmaturefemalerats:modulationofapoptosisandattenuationofglucose/insulinratio[J].IntJMolMed,2004,14(2):207-15.

[3] 乔 杰,李 蓉,李 莉,等.多囊卵巢综合征流行病学研究[J].中国实用妇科与产科杂志,2013,39(11):849-52.

[4] 张 璇,陈 捷,林 岚.卵巢打孔术配合苍附导痰汤治疗多囊卵巢综合征不孕疗效观察[J]. 广西中医药大学学报,2013,16(1):49 -51.

[5]AbramovichD,IrustaG,BasD,etal.Angiopoietins/TIE2systemandVEGFareinvolvedinovarianfunctioninaDHEAratmodelofpolycysticovarysyndrome[J].Endocrinology,2012,153(7):3446-56.

[6] 郑海珍,陈彩飞.达英-35、二甲双胍联合克罗米芬治疗多囊卵巢综合征不孕患者的临床疗效[J].中国妇幼保健,2010,25(30):4431-3.

[7] 孙园园,许小凤.子宫内膜容受性中西医实验研究进展[J].吉林中医药,2013,33(1):102-3.

[8]ClokeB,ChristianM.Theroleofandrogensandtheandrogenreceptorincyclingendometrium[J].MolCellEndocrinol, 2012,358(2):166-75.

[9] 张 婷,许彦来.补肾活血清肝方联合氯米芬治疗多囊卵巢综合征90例临床观察[J].中国中医基础医学杂志,2014,20(2):266-7.

Eeffects of Ding Kundan on the function of polycystic ovary model rats

SongYurong,WanWenyan,WeiBing

(Dept of Gynecology and Obstetrics,The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601)

Objective To study the influence of Ding Kundan on the reproductive function of polycystic ovary syn-

polycystic ovary syndrome; Ding Kundan; vascular endothelial growth factor ; homeobox gene A10

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.017.html

2016-05-30接收

国家自然科学基金青年科学基金(编号：81100412)；安徽省公益性研究联动计划项目(编号：5101ID04041)

安徽医科大学第二附属医院妇产科，合肥 230601

宋玉荣，女，硕士研究生；

卫 兵，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail:weibing1965@hotmai.com

R711.51

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.017

drome model rats.Methods The PCOS model was established by using testosterone propionate injection combined with humen chorinic gonadotropin to compare rat ovarian morphology, sex hormones levels,the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in ovary and homeobox gene A10(HOXA10) in uterus before and after drug administration.Results In a comparison to the model group,the number of ovarian corpus luteum of the Ding Kundan group was increased, and the serum luteinizing hormone(LH) and androgens (T) level of the Ding Kundan group declined, but follicle stimulating hormone(FSH) increased,the expression of VEGF in ovary reduced while HOXA10 in uterine rose. On top of that, their differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion Ding Kundan has the function of promoting ovulation and can increase the role of endometrial receptivity. The mechanism may relate to the regulation of the serum sex hormones levels, the decrease of VEGF expression in ovary, and the addition of HOXA10 in uterus in PCOS model rats.