小青龙汤联合玉屏风散对变应性鼻炎大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB表达的影响

马岩 王金昌 王树鹏

小青龙汤联合玉屏风散对变应性鼻炎大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB表达的影响

马岩 王金昌 王树鹏

目的 基于NF-κB信号通路观察小青龙汤联合玉屏风散对变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)大鼠鼻黏膜AQP5、NF-κB p65和p-CREB表达的影响,揭示小青龙汤联合玉屏风散治疗AR的作用机制及以饮论治AR的合理性。方法 将清洁级健康雄性Wistar大鼠48只随机分为6组,即分为正常组、AR模型组、Forskolin干预组、H89干预组、PDTC干预组、小青龙汤联合玉屏风散组,每组8只。采用卵蛋白全身致敏与局部攻击方法制作AR大鼠模型,观察小青龙汤联合玉屏风散组在治疗后鼻黏膜AQP5、NF-κB p65和p-CREB的表达。结果 模型组AQP5、p-CREB表达下调; Forskolin干预组、PDTC干预组、小青龙汤联合玉屏风散组均能使AQP5、p-CREB表达上调,而cAMP依赖蛋白激酶(protein kinase A,PKA)抑制剂H89能下调AQP5、p-CREB表达。模型组NF-κB p65表达上调,Forskolin干预组、PDTC干预组、小青龙汤联合玉屏风散组均能使NF-κB p65表达下调,而PKA抑制剂H89能上调NF-κB p65表达。结论 小青龙汤联合玉屏风散治疗变应性鼻炎作用机制可能与抑制NF-κB信号通路和兴奋cAMP-PKA信号通路使AQP5表达上调有关,为以饮论治AR奠定了现代生物学基础。

变应性鼻炎; 小青龙汤; 玉屏风散; NF-κB信号通路; cAMP-PKA信号通路

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是临床上的常见病、多发病。据统计,其在全球发病率约为25%～35%[1],部分地区甚至高达44.2%[2]。AR发病率呈现逐年上升的趋势,严重影响了患者的生活质量,己经成为影响人类健康的全球性问题之一。AR发作时会流大量清水涕,此症状与中医学“饮”的特点相似,而“饮”的生成又与肺脾肾三脏阳气虚弱密不可分[3],故从“阳气虚弱,水饮内停”立论,基于NF-κB信号通路,探讨“以饮论治”AR生物学基础研究,为“以饮论治”变应性鼻炎提供实验理论依据,进一步证实中医“以饮论治”的科学性。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级健康雄性Wistar大鼠48只,体质量为200～240 g,由辽宁中医药大学实验动物中心提供。合格证号:SCXK(辽)2010-0001。动物的一般状态好,鼻周无分泌物、无抓挠鼻现象、无喷嚏,皮毛光滑,活动及饮食正常,饲养于辽宁中医药大学动物实验中心,湿度适宜,室内通风及光线良好。饲料为标准动物饲料,由动物室提供。

1.2 药品与试剂

卵白蛋白:上海化学试剂厂,批号:20130108;卵白蛋白:上海化学试剂厂,批号:20130108。

抗原佐剂混悬液的组成:含卵白蛋白1 mg、氢氧化铝凝胶50 mL;核蛋白提取试剂盒(批号:BB-3166),购自上海邦奕生物科技有限公司;AQP5抗体(批号:bs-1554R),购自北京博奥森生物技术有限公司;p-CREB抗体(批号:bs-5270R),购自北京博奥森生物技术有限公司;HRP标记的二抗(批号: bs-0295G-HRP),购自北京博奥森生物技术有限公司;PVDF膜,购自北京索莱宝科技有限公司;蛋白marker,购自frements生产;Forskolin(批号:S1612),购自碧云天生物技术研究所;H89(批号:S1582),购自selleck生产。PDTC(批号:S1808),购自碧云天生物技术研究所;NF-κB p65抗体(批号:bs-20160R),购自北京博奥森生物技术有限公司; β-actin抗体(批号:bs-0061R),购自北京博奥森生物技术有限公司;Histone H2A抗体(批号:bs-3781R),购自北京博奥森生物技术有限公司;ECL发光试剂盒、SDS-Page凝胶试剂盒和总组蛋白提取试剂盒均购于碧云天生物。

1.3 分组和造模

将大鼠按体重采用随机区组法分为6组,即分成正常对照组、AR模型组、Forskolin干预组、H89干预组、PDTC干预组、小青龙汤联合玉屏风散组,每组8只。按照刘建国等[4]对变应性鼻炎大鼠模型建造,采用卵蛋白全身致敏与局部攻击方法制作AR大鼠模型。除正常对照组外,各组以5%卵蛋白混悬液致敏,腹腔注射,1次/天,共7次;正常对照组:以等量生理盐水替代5%卵蛋白混悬液,方法和步骤同实验组。除正常对照组外,各组于第15天起,用5%卵蛋白混悬液100 μL双侧滴鼻,每侧50 μL,1次/天,共7次;正常对照组:以等量生理盐水替代5%卵蛋白混悬液,方法和步骤同实验组。

症状分级标准:鼻痒计分,轻擦鼻几下(＜5)计1分;抓挠鼻面不止,到处擦(5～10),计2分;抓挠鼻面不止,到处擦(＞10)计3分;喷嚏计分,1～3个计1分,4～10个计2分,11个以上计3分;鼻涕计分,流到鼻前孔计1分,超过鼻前孔计2分,流涕满面计3分。记录时以叠加记总分,总分超过5分者为模型成功。观察时间为给药后30分钟。

1.4 给药

按照《药理实验方法学》人与动物等效剂量换算方法,人与大鼠药物每公斤体重剂量之比约为1∶6,因此各组药物灌胃剂量如下:(1)正常对照组:按照每100 g大鼠体质量予以1 mL生理盐水灌胃;(2)模型组:同正常对照组;(3)Forskolin干预组:按按5 mg/(kg·d)腹腔注射;(4)H89干预组:按按5 mg/(kg·d)腹腔注射;(5)PDTC干预

组:按50 mg/(kg·d)腹腔注射;(6)小青龙汤联合玉屏风散组:按每1 kg大鼠体重予以8.4 mL所试药物煎剂(相当于8.4 g生药)灌胃。每天灌胃1次。

1.5 喷嚏、鼻抓痒计数

在处死前,给予5%卵蛋白混悬液100 μL滴鼻,观察30分钟并计数。鼻涕计分:在处死前,给予5%卵蛋白混悬液100 μL滴鼻,观察30分钟并计分。

1.6 取材

大鼠于最后1次灌胃后,腹腔注射1%苯巴比妥(40 mg/kg)麻醉,断头处死大鼠,同时取外周血,静置,3000 rpm,离心5分钟,取上清于冻存管中,-80℃存放备用。鼻背正中切开,迅速取出鼻中隔和鼻腔外侧壁呼吸区粘膜组织,黏膜组织迅速投入4%中性多聚甲醛溶液中(PH值约7.2)中,4℃固定过夜,双蒸水冲洗25分钟,存放于75%乙醇溶液, 4℃保存。

1.7 检测指标

应有Western blotting检测核转录因子κB p65 (nuclear transcription factor κB p65,NF-κB p65)表达、磷酸化cAMP应答元件结合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein,p-CREB) (Ser133)表达、水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)表达,具体操作方法按照说明书进行。抗体的稀释比例:AQP5多克隆抗体l:200、p-CREB(Ser133)单克隆抗体1∶500、β-actin多克隆抗体1∶1000、Histone H2A-1多克隆抗体1∶300、β-actin多克隆抗体1∶250。

1.8 统计学处理

实验数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,各组数据均符合正态分布,且方差齐,故多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗后各组大鼠行为学指标比较

模型组与正常对照组相比较有显著性差异(P＜0.05),说明变应性鼻为大鼠造模成功。与模型组相比较,Forskolin干预组、PDTC干预组、H89干预组鼻和小青龙汤联合玉屏风散组大鼠在治疗后抓痒次数、喷嚏次数以及鼻涕计分均有所下降,差异均有统计学意义(P＜0.05)。Forskolin干预组、PDTC干预组与小青龙汤联合玉屏风散组比较无显性差异(P＞0.05),H89干预组与小青龙汤联合玉屏风散组比较有显性差异(P＜0.05),见表1。

表1 变应性鼻炎大鼠行为学指标改变次数与计分(±s)

表1 变应性鼻炎大鼠行为学指标改变次数与计分(±s)

注:与正常对照组比较,aP＜0.05;与模型组比较,bP＜0.05;与小青龙汤联合玉屏风散组比较,cP＜0.05。

鼻抓痒次数喷嚏次数鼻涕计分正常对照组组别n 84.1±1.52.4±0.91.1±0.4模型组831.4±3.7a18.5±3.6a2.8±0.5aForskolin干预组84.9±1.8b3.0±0.8b1.5±0.5bH89干预组834.8±3.3bc23.3±2.9bc2.9±0.4cPDTC干预组84.9±1.5b3.4±0.9b1.4±0.5b小青龙汤联合玉屏风散组84.5±1.5b2.8±0.7b1.3±0.5b

2.2 治疗后各组大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB表达量的比较

与正常对照组比较,模型组AQP5相对蛋白表达量显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.01); H89干预组AQP5相对表达量与模型组相比较显著降低(P＜0.01)。Forskinlin干预组、PDTC干预组、小青龙汤合玉屏风治疗组AQP5相对蛋白表达量与模型组相比较显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。Forskolin干预组、PDTC干预组与小青龙汤联合玉屏风散组比较无显性差异(P＞0.05),H89干预组与小青龙汤联合玉屏风散组比较有显性差异(P＜0.01)。

模型组NF-κB p65相对蛋白表达量较正常组显著升高,差异具有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,H89干预组NF-κB p65表达量升高(P＜0.05), Forskinlin干预组、PDTC干预组、小青龙汤联合玉屏风治疗组NF-κB p65表达量显著降低(P＜0.01)。Forskolin干预组、PDTC干预组与小青龙汤联合玉屏风散组比较无显性差异(P＞0.05),H89干预组与小青龙汤联合玉屏风散组比较有显性差异(P＜0.01)。

与正常对照组比较,模型组p-CREB(Ser133)相对蛋白表达量显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,H89干预组p-CREB (Ser133)表达量显著降低(P＜0.01),而Forskinlin干预组、PDTC干预组、小青龙汤联合玉屏风治疗组p-CREB(Ser133)相对蛋白表达量显著升高(P＜0.01)。Forskolin干预组、PDTC干预组与小青龙汤联合玉屏风散组比较无显性差异(P＞0.05), H89干预组与小青龙汤联合玉屏风散组比较有显性差异(P＜0.01)。见表1、图1。

表2 治疗后各组大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB相对表达量比较(±s)

表2 治疗后各组大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB相对表达量比较(±s)

注:与正常对照组比较,aP＜0.01;与模型组比较,bP＜0.01;与小青龙汤联合玉屏风散组比较,cP＜0.01。

B p65p-CREB正常对照组组别nAQP5NF-κ 80.66±0.060.00±0.000.66±0.05模型组80.31±0.04a0.66±0.05a0.43±0.06a Forskolin干预组80.63±0.05b0.60±0.08b0.65±0.04bH89干预组80.23±0.02bc0.72±0.03bc0.23±0.05bcPDTC干预组80.65±0.04b0.58±0.04b0.67±0.05b小青龙汤联合玉屏风散组80.60±0.04b0.57±0.05b0.62±0.05b

图2 治疗后各组大鼠AQP5、NF-κB p65和p-CREB在鼻黏膜的相对表达量

3 讨论

3.1 AQP5与变应性鼻炎

腺体过度分泌是AR最基本病理特征之一,临床表现多为鼻腔大量清水涕,严重影响人们的工作与生活质量。研究AR过度分泌性的机制和如何有效地控制腺体的过度分泌是当前AR研究的重点之一。AQP5可能参与气道液体分泌的过程,同时还是腺体上皮细胞腔膜面水转的限速屏障。在本实验中模型组AQP5的表达下调,说明AQP5是变应性鼻炎发病环节之一,水通道蛋白对维持人体的生理状态的作用十分重要[5]。有研究资料表明,水通道蛋白在体内液体转运和分泌方面发挥着重要的作用。随着对体内各系统水通道蛋白的深入研究,鼻腔黏膜水通道蛋白的分布、调节及生理学意义也逐渐清晰,其中AQP5与气道内液体转运密切相关[6]。cAMP激活剂Forskolin干预组、NF-κB抑制剂PDTC干预组、小青龙汤联合玉屏风散治疗组均能使AQP5表达上调,而PKA抑制剂H89能下调AQP5表达,说明小青龙汤合玉屏风散作用机制可能与NF-κB信号通路和cAMP-PKA信号通路有关。

3.2 NF-κB p65与变应性鼻炎

在本实验中,正常组NF-κB p65未能检测到,可能与其表达量很少有关。当AR大鼠经过卵蛋白基础致敏和局部鼻腔激发后,NF-κB被激活后大量表达,AQP5表达下调,NF-κB抑制剂PDTC干预AR大鼠抑制NF-κB通路后,致使AQP5表达上调,表明NF-κB是变应性鼻炎发病的中心环节。小青龙汤联合玉屏风散组亦能减少NF-κB表达,而其又能使AQP5表达上调,其可能的作用机制是抑制NF-κB信号通路的激活使AQP5表达上调,因激活后的NF-κB信号通路与cAMP-PKA-p-CREB竞争性结合转录辅助因子CBP,从而下调AQP5的表达。

3.3 p-CREB(Ser133)与变应性鼻炎

cAMP激活剂Forskolin能上调p-CREB (Ser133)表达,PKA抑制剂H89能下调p-CREB (Ser133)表达,表明cAMP-PKA-CREB信号转导通路是变应性鼻炎发病重要环节之一。在NF-κB被激活后,p-CREB表达下调;PDTC干预AR大鼠抑制NF-κB通路后,p-CREB(Ser133)表达上调,这可能与NF-κB p65和转录辅助因子CBP相互作用有关。NF-κB和CREB都易受到CBP的调控[7],NF-κB只有在细胞核内与CBP结合才具有基因转录活性,但是CBP除了与NF-κB结合诱导基因转录以外,还能和p-CREB结合[8]。NF-κB与p-CREB(Ser133)竞争性结合CBP诱导特定靶基因转录,而细胞核内CBP表达量是相对有限的,NF-κB与p-CREB (Ser133)竞争性结合相对有限的CBP必然会导致依赖cAMP-PKA-CREB的基因转录下调[9]。小青龙汤联合玉屏风散能够抑制NF-κB信号通路的激活,通过cAMP-PKA-CREB信号通路与CBP的结合,上调p-CREB表达,从而使AQP5表达增加。

综上所述,小青龙汤联合玉屏风散治疗AR的作用机制是抑制NF-κB信号通路的激活和兴奋cAMP-PKA信号通路使AQP5表达上调,从而使AR的症状缓解,为以饮论治AR奠定了现代生物学基础。

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Exploring the effect of Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng powder on the expression of AQP5, NF-κB p65 and p-CREB in rats with allergic rhinitis

MA Yan,WANG Jin-chang,WANG Shu-peng. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China

WANG Shu-peng,E-mail:sywangshupeng@163.com

Objective To observe the effect of the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power on the expression of AQP5、NF-kappaB p65 and p-CREB in nasal mucosa of allergic rhinitis rats in NF-kappaB signaling pathway,and reveal the mechanism of the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power in treating AR and the rationality of treating AR by phlegm and retained fluid.Methods 48 healthy male Wistar rats were divided into 6 groups by randomized bocks design:normal group,AR model group, Forskolin(cAMP activator)group,H89(PKA inhibitor)group,PDTC(NF-kappa B inhibitor),and the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power group,8 rats in each group.The AR rat model was made by the method of whole body sensitization and local attack.The expression of AQP5,NF-kappaB p65 and p-CREB were observed after the treatment.The results were statistically analyzed.Results The expression of AQP5 and p-CREB in the model group was decreased,and the expression of AQP5 and p-CREB in the Forskolin group,PDTC group,the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power group was increased, while the PKA inhibitor H89 could decrease the expression of AQP5.The expression of NF-kappaB p65 in the model group was increased,and the expression of NF-kappaB p65 in the Forskolin group,PDTC

Allergic rhinitis; Xiaoqinglong decoction; Yupingfeng power; NF-κB signal pathway; cAMP-PKA signaling pathway

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.11.009

2016-01-08)

(本文编辑:韩虹娟)

辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2013374)

110847 沈阳,辽宁中医药大学基础医学院

马岩(1985-),硕士,医师。研究方向:经方治疗免疫性疾病的研究。E-mail:894957892@qq.com

王树鹏(1973-),博士,教授,硕士生导师。研究方向:经方治疗免疫性疾病的研究。E-mail:sywangshupeng@163.com

group,the Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng power group was decreased,while the PKA inhibitor H89 could increase the expression of NF-kappaB p65. Conclusion Xiaoqinglong decoction and Yupingfeng powder treatment of allergic rhinitis mechanism may be related to the inhibition of NF-kappa B signaling pathway and cAMP-PKA signaling pathway to increase the AQP5 expression,which has laid the foundation of modern biology for treating AR by phlegm and retained fluid.