马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定

魏桂民，李德文，罗莉斯，王少铭，王军，张金

(1.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070；2.贵州省油料(香料)研究所，贵州 贵阳 550006)



马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定

(1.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070；2.贵州省油料(香料)研究所，贵州 贵阳 550006)

【目的】 克隆马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)的启动子序列并对其进行功能鉴定.【方法】 采用染色体步移技术(genome walking)进行启动子的克隆，构建了该启动子驱动报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304sgt3p，以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体，采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及稳定遗传转化，结合GUS组织化学染色对其进行功能鉴定.【结果】 电泳图表明为1条长约2 500 bp的特异扩增条带，瞬时表达和稳定遗传表达的烟草叶片的GUS组织化学染色结果均显示gus基因在转化烟草叶片中高效表达，并且低于阳性对照，非转化烟草叶片中无表达.【结论】成功克隆到sgt3基因起始密码子上游2 392 bp的启动子序列并且该启动子具有活性.

马铃薯；茄啶鼠李糖基转移酶；启动子克隆；功能鉴定

碱糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloids，SGAs)，又名马铃薯素或龙葵素，是一类重要的植物次生代谢产物，主要存在于茄科(Solanaceae)和百合科(Liliaceae)植物中.现已被认为是人类食物中最严重的有毒物质之一.它对病毒、真菌、细菌、昆虫、原虫、蠕虫、其他植物以及哺乳动物和人都具有生物学作用[1-4].在马铃薯(Solanumtuberosum)栽培种中，95%的糖苷生物碱是以α-茄碱(α-solanine)和α-卡茄碱(α-chaconine)的形式存在[5-6].α-茄碱和α-卡茄碱有相同的糖苷配基—茄啶(solanidine )，但在碳水化合物组成结构上有所不同[4].它密切关系着块茎的食用和加工品质、马铃薯自身的抗病虫能力以及其遗传育种[7].茄啶鼠李糖基转移酶(solanidine rhamnosyltransferase，SGT3)是SGAs生物合成过程末端代谢支路的关键酶之一，它催化β-卡茄碱和β-茄碱转化为α-卡茄碱和α-茄碱[8-9].

启动子是一段能与RNA聚合酶以及其转录因子特异结合，从而起始基因转录的序列，是基因表达调控的重要元件.一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box，它们分别是依赖DNA的RNA聚合酶的识别位点和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处.启动子上含有顺式作用元件，转录因子与之结合，从而抑制或激活基因的转录.启动子在一定程度上决定了基因表达的时间以

及空间顺序[10-12].

为了研究茄啶鼠李糖基转移酶基因的调控特点，本研究从‘庄薯3号’中克隆了其上游调控序列，并用PLACE和PLANTCARE进行生物信息学分析，并进行瞬时表达，分析了该启动子的活性.本研究有助于深入了解sgt3基因高表达并积累SGAs的分子机制，为进一步开展糖苷生物碱合成的时空调控提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

参考魏桂民等[13]的试验材料，光敏感型马铃薯‘庄薯3号’，野生型(wild-type)烟草‘T12’，所用菌株均为本实验室(甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室)保存，载体，Genome Walking Kit等均从公司购买.

1.2 试验方法

1.2.1 PCR引物的设计、合成 根据在NCBI网站中查询的马铃薯sgt3基因的cDNA序列(登录号为GI：82590366)，在5′端上游保守序列处设计3条特异性引物(SP1、SP2、SP3，表1)用Primer Primer 5.0软件，SP3的位置在SP2、SP1的内侧，随机引物由试剂盒提供.

表1 启动子PCR扩增特异引物

1.2.2 马铃薯sgt3基因启动子序列的克隆 参考魏桂民等[13]方法，分别以上述合成的特异引物SP1、SP2、SP3和随机引物AP1的组合为引物，采用染色体步移技术进行3轮PCR扩增.

PCR产物的回收纯化及连接和转化及蓝白斑筛选参考魏桂民等[13]的方法，将鉴定为阳性的菌液送测序公司进行测序，目的序列命名为sgt3p.

1.2.3 马铃薯sgt3基因启动子序列的生物信息学分析 参考魏桂民等[13]的方法对测序得到的启动子的转录起始位点、潜在的顺式元件等进行预测分析.

1.2.4 植物表达载体的构建 选用pCAMBIA1304为基本双元载体.根据1.2.2中的测序结果设计特异引物sgt3F:5′-GTTGTATGGACC TTTTGGTTTGGAT-3′，sgt3R:5′-GTTCCTTCACTTCAGTTGACTCGTA-3′，以1.2.2中构建的重组质粒为模板，扩增起始密码子上游DNA序列，正向引物的5′端引入KpnⅠ酶切位点,反向引物的5′端引入NcoⅠ酶切位点.将PCR产物克隆到pMD19-T载体上，得到pMD19-sgt3p克隆，双酶切pMD19-sgt3p质粒和pCAMBIA1304载体，连接回收产物，使起始密码子上游DNA序列替换pCAMBIA1304载体上的CaMV35S启动子，得到植物双元表达载体p1304sgt3p (图3)，含sgt3p::gfp::gus融合基因.以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体，由CaMV35S启动子驱动gus基因表达.

1.2.5sgt3p::gfp::gus在烟草叶片中的瞬时表达 参考魏桂民等[14]的方法进行瞬时表达，参考Jefferson等[15]的方法，进行GUS组织化学染色.以表达载体pCAMBIA1304转化的烟草叶片为阳性对照，非转化烟草叶片作为阴性对照.

1.2.6sgt3p::gfp::gus在烟草中的稳定表达 参考魏桂民等[13]的方法进行转基因，以潮霉素筛选转基因烟草，所获得的抗性植株以hpt-F(5′-ACACAGCCATCGGTCCAGAC-3′ )及hpt-R(5′-ATCTTAGCCAGACGAGCGGG-3′ )引物进行核基因组DNA为模板的PCR检测，扩增589 bp的hpt基因片段，取阳性植株顶部第3个叶片参考Jefferson等[15]的方法，进行GUS组织化学染色.以表达载体pCAMBIA1304转化的烟草为阳性对照，非转化烟草作为阴性对照.

2 结果与分析

2.1 马铃薯sgt3基因启动子序列的克隆

扩增产物如图1，电泳图表明为1条长约2 500 bp的特异扩增条带(图1).

2.2 马铃薯sgt3基因启动子序列的生物信息学分析

将克隆得到的茄啶鼠李糖基转移酶基因的启动子序列，通过在线分析软件PLACE分析程序和PLANTCARE分析程序，分析核心启动子区域和顺式调控元件.发现该序列具有核心启动子元件CAAT-box和TATA-box(图2)，起始密码子上游17 位点处的G为可能的转录起始位点，启动子序列存在大量的与光响应有关的元件，还有一些与环境及植株发育相关的元件(表2，图2).表明，所克隆的sgt3基因起始密码子上游2 392 bp序列为启动子区域序列，它包含各种响应马铃薯植株发育信号及外界环境刺激的顺式作用元件.

M：DNA marker DL5000；1-2： sgt3启动子扩增产物.图1 sgt3启动子的PCR扩增Fig.1 PCR amplications of sgt3 promoter

2.3 p1304sgt3p双元表达载体的构建

按图3-A的流程构建植物双元表达载体.构建的p1304sgt3p载体用KpnⅠ和NcoⅠ双酶切检测，结果可切下相应大小的DNA片段(图3-B).

2.4 Sgt3p驱动gus基因在烟草叶片中的瞬时表达

将上述构建的植物表达载体p1304sgt3p和阳性对照pCAMBIA1304表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404，采用叶盘法转化烟草， GUS组织化学染色结果显示(图4)，sgt3p驱动gus基因在烟草叶片中达，其表达强度低于CaMV35S启动子的表达强度，非转基因烟草叶片中无GUS表达.

2.5 Sgt3p驱动gus基因在烟草叶片中的稳定表达

将检测为阳性植株的烟草，取顶部第3个叶片进行GUS组织化学染色，结果如图5，sgt3p驱动gus基因在转基因烟草叶片中达，其表达强度低于CaMV35S启动子的表达强度，非转基因烟草植株叶片中无GUS表达.

3 讨论

本研究采用染色体步移技术首次克隆了马铃薯sgt3基因起始密码子上游2 392 bp的启动子区域序列(图2).利用PLACE分和PLANTCARE进行生物信息学分析，发现其中存在大量的与光响应有关的元件，如Ⅰ-box，GA-motif，G-Box，Box4，-10PEHVPSBD，Sp1等，还有一些与环境相关的元件如ACGTATERD1，ABRELATERD1，ARE，Box-W1，GAREAT(图2，表2).表明该启动子可能为诱导型启动子，特别受光诱导，还受水分胁迫、逆境、厌氧、赤霉素、脱落酸等诱导.而前人研究结果也表明：光照条件下，马铃薯块茎中糖苷生物碱会快速合成，其含量比没有光照的条件时增加将近1倍[16]；而王旺田等[17]，季彦林等[18]的报道也表明，红光是诱导马铃薯块茎糖苷生物碱积累的重要信号；除受遗传因子决定外，多样的环境因素亦使马铃薯块茎中糖苷生物碱的含量差异显著[19]，这与本研究分析结果相一致.

表2 sgt3启动子区域中的调控基序

黑色加粗字母为预测的转录起始位点，被定义为+1，各种顺式调控元件用下划线标出并在在序列的上方注明图2 ‘庄薯3号’sgt3基因的启动子序列Fig.2 Nucleotide sequence of the sgt3 promoter region

瞬时表达是指引入细胞的外源 DNA和宿主细胞染色体 DNA 并不发生整合，而是随载体进入细胞后12 h左右就可表达，基因产物在2～4 d内即可被检测出.因此具有简单、快速、周期短、准确等优点，弥补了常规转基因方式周期长、转化效率低等缺点[20-21].它不受基因位置效应、基因沉默的影响，表达效率较稳定，转化率高.本研究采用这一技术，将构建的植物双元表达载体p1304sgt3p(图3)导入烟草叶片，以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体，由CaMV35S启动子驱动gus基因的表达，结合GUS组织化学染色，结果表明gus基因在转化p1304sgt3p的烟草叶片中高效表达，其表达强度低于强启动子CaMV35S驱动的gus基因的表达强度，而非转化烟草叶片中无gus基因的表达(图4).这与稳定遗传表达结果相一致，本研究将构建的植物双元表达载体p1304sgt3p(图3)采用农杆菌叶盘转化法转化烟草，以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体，以潮霉素筛选转基因烟草，将所获得的抗性植株进行PCR检测后，取阳性植株顶部第3个叶片进行GUS组织化学染色，结果同样(图5)表明gus基因在转化p1304sgt3p的烟草植株中的叶片高效表达，并且低于强启动子CaMV35S驱动的gus基因的表达强度，非转化烟草植株叶片中无gus基因的表达.这表明了瞬时表达具有一定的可靠性.本研究瞬时表达和稳定遗传表达结果共同表明了所克隆的启动子具有活性，能驱动gus基因在烟草叶片中高效表达，为今后开展SGAs生物合成的时空调控，利用基因工程技术培育出马铃薯新型品种奠定基础.

A：表达载体构建流程图；B：表达载体p1304sgt3p的酶切检测；M：DNA marker DL2000；1：KpnⅠ和NcoⅠ双酶切检测.图3 马铃薯sgt3基因启动子驱动报告基因的p1304sgt3p双元表达载体的构建Fig.2 Fig.3 Construction of binary vector p1304sgt3p harboring reporter gene driven by sgt3 gene promoter

A：sgt3p::gfp::gus；B：CaMV35S::gfp::gus；C：wild-type.图4 sgt3p::gfp::gus在烟草叶片中瞬时表达的GUS组织化学分析Fig.4 Transient expression of gus gene driven by sgt3p in tobacco leaves

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(责任编辑 李辛)

Cloning and functional identification of potatosgt3 gene promoter

WEI Gui-min1,2LI De-wen2,LUO Li-si2,WANG Shao-ming2,WANG Jun2,

(1.Gansu Key Lab of Crop Improvement & Germplasm Enhancement，College of Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China；2.Guizhou Institute of Oil (Spice) Crops,Guiyang 550006,China)

【Objective】 To clone the promoter sequence of 5′ upstream of initial codon of the potato gene of solanidine galactosyltransferases (sgt3) and identify its function.【Method】 The promoter sequence was cloned by using the Genome walking and then was fused withgfp::gusgene originated from pCAMBIA1304 to construct a binary vector p1304sgt3p.The vector pCAMBIA1304 was used as a positive control expression vector.And they were introduced into wild type tobacco leaves through Arobacterium mediated instantaneous expression and stable genetic transformation to identify the function of the promoter sequence.【Result】 Electrophoregram shows that a pecific amplification bands about 2 500 bp was cloned.The GUS staining showed that gus gene was highly expressed both in transgenic tobacco leaves and instantaneous expression blade,and the expression was lower than that in positive control,and there was no epression in the wild type tobacco leaves.【Conclusion】 The 2 392 bp promoter sequence of 5′ upstream of initial codon of sgt3 gene cloned was successfully cloned,and the promoter had activity.

solanum tuberosum；solanidine rhamnosyltransferase；promoter cloning；functional identification

魏桂民(1986-)，女，研究实习员，硕士，主要从事香料研究.E-mail：wgm6204@126.com

张金文，男，教授，博导，主要从事作物改良研究.E-mail:jwzhang305@163.com

国家自然科学基金项目(31260343)；科技部国家重点基础研究发展计划(973计划)前期项目(2010CB13400)；甘肃省自然科学基金项目(0710RJZA088).

2015-12-03；

2016-01-13

S 532

A

1003-4315(2016)05-0032-07