桔青霉降解茶皂素的实验研究

黄 浦，肖 瑜，刘以清，覃 妍，陈菊清，杨 森

（桂林理工大学a.广西危险废物处置产业化人才小高地；b.广西矿冶与环境科学实验中心，广西　　桂林 541004）

桔青霉降解茶皂素的实验研究

黄 浦，肖 瑜，刘以清，覃 妍，陈菊清，杨 森

（桂林理工大学a.广西危险废物处置产业化人才小高地；b.广西矿冶与环境科学实验中心，广西桂林 541004）

茶皂素是油茶饼粕中重要的组成成分，是影响油茶粕作为饲料利用的主要原因。为了得到桔青霉降解茶皂素的最佳发酵条件，对发酵前后产物进行了研究，以茶皂素（tea saponin）标准品为原料，以茶皂素降解率为指标，利用桔青霉液态发酵降解茶皂素。通过对培养时间、培养温度、摇床转速、接种量等单因素的研究，确定其最佳的发酵条件为：发酵时间13 d，发酵温度31℃，转速150 r/min，接种量6 mL，在此条件下，茶皂素的降解率达到了36.71%，并用GC-MS对发酵前后产物进行了分析。

油茶粕；茶皂素；桔青霉；液态发酵

0 引 言

油茶粕是油茶榨取茶油后的副产物。齐小健等［1］研究表明，油茶粕组成为：粗蛋白15%，粗脂肪5%，糖类40%，粗纤维6%，茶皂素10%～4%，灰分6%，单宁2%，咖啡碱0.95%，水分14%，同时，油茶粕中富含Mg、Fe、Ca、Mn、Zn、Cu等多种无机微量元素。茶皂素（tea saponin）又名茶皂甙、皂角苷、皂苷，主要分布于茶叶、茶籽、茶根等部位，茶皂素属于五环三萜类皂甙，由甙元、糖和有机酸三部分组成。经提纯后的茶皂素是乳白色或淡黄色无定形粉末，是一种非离子型极性物质，具有辛辣、刺鼻的特性，是影响油茶粕作为饲料使用的主要因素，同时，茶皂素还具有溶血毒性和鱼毒性。

邓元荣等［2］研究了油茶皂苷的体外溶血，结果表明，油茶皂苷低浓度时无溶血作用，大于一定浓度时则具有溶血作用，且溶血强度与浓度呈剂量依赖性。罗毅志等［3］研究表明，茶皂素对红细胞有很强的溶血作用，红细胞一旦接触茶皂素都会产生溶血毒性。首先是破坏细胞膜，随后就可以观察到细胞质慢慢外渗，最后整个完整的细胞膜完全被破坏，有核的细胞就只剩下细胞核，无核的红细胞则成一片胶质状态，但是茶皂素不会对白细胞产生任何毒性。

利用微生物产酶进行酶解的方法进行油茶粕脱毒属于茶油粕的一个新的领域，具有成本低、重复性好、工艺简单、设备要求低等特点［4］。桔青霉（Penicillium citrinum）常见于腐烂的水果、蔬菜、粮食、肉类、皮革和食物上，呈灰绿色。桔青霉是工业生产中的重要菌种，如用于核酸酶P1、醛酮氧合酶、脂肪酶、果糖氧化酶的生产等［5］。梁剑光等［6］对桔青霉发酵的工艺进行了相关研究，结果表明，种龄24 h、接种量10%、初始pH 6.5条件下，较高的发酵温度下产酶最高点明显提前，而较低温度下，发酵周期延长，但有利于菌体产酶。王端好等［7］研究了溶氧对桔青霉发酵产核酸酶的影响，发现摇瓶装液量为20%、摇床转速为180 r/min时产酶最好，表明桔青霉菌产酶需要较高的溶氧。

为了对油茶粕进行脱毒，降低茶皂素的含量，本研究利用桔青霉对其液态摇床发酵，以茶皂素降解率为指标，通过单因素实验来确定其最佳的发酵条件，最后，通过GC-MS对其发酵前后产物进行分析。

1　材料和仪器

1.1菌种

桔青霉（Penicillium citrinum）购买于广东省微生物研究所菌种保藏中心。

1.2原料与培养基

茶皂素标准品（纯度在98%以上）购于长沙哈根生物科技有限公司。

斜面培养基：葡萄糖（20 g/L），马铃薯汁，硫酸镁（0.5 g/L），磷酸二氢钾（1 g/L），硫胺素（8 mg/L），琼脂（20 g/L），pH自然。

发酵培养基：茶皂素标准品（20 g/L），硫酸镁（0.5 g/L），磷酸二氢钾（1 g/L），硫胺素（8 mg/L），pH自然。

1.3主要仪器及设备

Clarus 680气相色谱-质谱联用仪，美国PE公司；Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱，美国安捷伦公司；SH Z-B水浴恒温振荡器，上海安亭科学仪器厂；TGL-18000cR高速台式冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；AR224CN电子分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；SN-GJ -2FD洁净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LTFG-通风柜，深圳市利龙湖实业有限公司；YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司；广口锥形瓶。

1.4主要化学试剂

甲醇（色谱纯），四氯化碳（色谱纯），葡萄糖，硫酸镁，磷酸二氢钾，硫胺素，琼脂粉（分析纯）。

2　实验方法

2.1茶皂素标品标准曲线的制定

准确称取2.5 g茶皂素标准品，定容于250 mL的容量瓶中，为10 mg/mL标准液，准确量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL标准液于10 mL的比色管中，分别用甲醇（色谱纯）定容至刻度线，摇匀，用注射器抽取一定量液体，过0.45 μm的针头过滤器，注入1.5 mL液相进样瓶中，最终置于液相色谱仪中进行测定，高效液相色谱洗脱方式为纯甲醇以0.5 mL/min的速度洗脱，进样量为2 nL，柱箱温度30℃，检测波长218 nm。当拟合直线相关系数达到0.999以上为合格，如图1所示。

图1　茶皂素的标准曲线Fig.1 Tea saponin standard curve

2.2桔青霉菌悬液的制备

用压力蒸汽灭菌锅灭菌250 mL超纯水、2个250 mL的广口锥形瓶，于121℃高温下灭菌30 min，将灭菌过后的无菌水及锥形瓶放在洁净工作台上，紫外杀菌30 min，冷却至室温，再倒入少量无菌水于斜面培养基中，用涂布棒轻轻将桔青霉的菌落撮取下来，倒入250 mL广口锥形瓶中，放入25℃、150 r/min的水浴恒温振荡器中旋转振荡30 min，再用棉花挡住瓶口，过滤到另一灭菌后的250 mL广口锥形瓶中，最后放入冷藏柜中保存备用。

2.3桔青霉时间单因子的确定

按发酵时间1～15 d进行三角瓶液态发酵实验，每天取样，提取出发酵液，测定其茶皂素的浓度，以确定最佳发酵时间。

2.4桔青霉温度单因子的确定

在最佳的发酵时间下，分别将三角瓶放入15、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和55℃的水浴恒温振荡器中进行发酵，提取出发酵液，测定其茶皂素的浓度，以确定最佳发酵温度。

2.5桔青霉转速单因子的确定

在最佳时间、温度的条件下，分别将三角瓶放入到设置为120、150、180、210、240 r/min的水浴恒温振荡器中发酵，提取出发酵液，测定其茶皂素的含量，以确定最佳的转速。

2.6桔青霉接种量单因子的确定

在最佳发酵时间、温度及转速的条件下，分别向装有液态培养液的三角瓶中加入0.5、1.0、3、6、9、12、15 mL桔青霉菌悬液，取出发酵液，测定其茶皂素的浓度，以确定最佳接种量。

2.7气相色谱-质谱分析

将发酵液装入分液漏斗中，用四氯化碳进行液液萃取，放在通风厨上让其分层，当出现明显的分层后，再将下部分萃取得到的白色乳化状的液体放入到高速台式冷冻离心机中进行离心，将得到的透明液体进行氮气吹脱、浓缩，最终将浓缩至2 mL的液体过0.45 μm的针头过滤器，装入进样瓶，进行气相色谱-质谱联用测试。

3　结果与分析

3.1茶皂素标准品HPLC图谱

茶皂素的标准品HPLC图谱见图2。

图2　茶皂素标准品　HPLC图Fig.2 Tea saponin standard HPLC

3.2时间对桔青霉发酵降解茶皂素的影响

由图3可见，时间单因子实验按2.3节所述方法进行，以茶皂素作为桔青霉新陈代谢的唯一碳源，随着发酵时间的延长，茶皂素的降解率呈现出一种稳步增高的趋势，可能是由于桔青霉的大量生长繁殖，消耗了大量的能源物质，当培养到第13d时，桔青霉生长达到稳定期，降解对能源物质的消耗达到了动态平衡，降解效果最佳，茶皂素的降解率达到了23.17%，因而可知，茶皂素最佳的培养时间为13 d。

图3　时间对茶皂素降解的影响Fig.3 Time influence on the degradation of tea saponin

3.3温度对桔青霉发酵降解茶皂素的影响

由图4可知，温度单因子实验按2.4节所述方法进行，在较高或者较低的温度环境条件下培养，茶皂素的降解效果很不理想，这是因为高温或低温限制桔青霉的新陈代谢，降低了酶的产出；当培养温度为31℃时，茶皂素降解效果最好，在31℃周围，随着温度变化，茶皂素降解率变化很大，说明温度对桔青霉新陈代谢和酶解有着重要的作用，得到最佳的培养温度为31℃。

图4　温度对茶皂素降解的影响Fig.4 Temperature influence on the degradation of tea saponin

3.4转速对桔青霉发酵降解茶皂素的影响

由图5可知，转速单因子实验按2.5节所述方法进行，随着摇床转速的变化，茶皂素的降解率呈现先增高后降低的趋势。因为桔青霉是一种好氧菌，转速过低，溶解氧不足，影响其新陈代谢，导致产酶较少，对茶皂素的降解比较有限；当转速过快、溶解氧含量过高时，可能是过高的氧会转化成超氧化物基·和过氧化物基·或羟基自由基（·OH），破坏微生物细胞组分，或者是过高的转速不利于菌胶团的形成，从而影响到桔青霉对茶皂素的降解。

图5　转速对茶皂素降解的影响Fig.5 Rotate speed influence on the degradation of tea saponin

3.5接种量对桔青霉发酵降解茶皂素的影响

由图6可知，接种量单因子实验按2.6节所述方法进行，随着桔青霉接种量的增加，茶皂素的降解率呈现出先上升后下降的趋势。接种量从0.5 mL增加到1 mL的过程中，茶皂素降解率变化较大，主要是因为营养物质充足，能够提供微生物大量生长，能源物质被大量消耗。当接种量为6 mL时，降解率达到了最佳状态36.71%，继续增加接种量，茶皂素降解率有所降低，最终趋于稳定，可能是微生物之间出现营养物质的相互竞争关系，使活菌体数维持在一个动态平衡，因而茶皂素降解率也趋于稳定，得出最佳的接种量为6 mL。

图6　接种量对茶皂素降解的影响Fig.6 Inoculum size influence on the degradation of tea saponin

3.6气相色谱-质谱分析

将桔青霉发酵前和发酵后的发酵液分别用四氯化碳进行液液萃取，对萃取液作气相色谱-质谱联用分析。对比GC-MS图谱可知，在热带假丝酵母的降解作用下生成了新物质，新物质通过GCMS检索为：［1-Benzyl-2-o-toyl-ethyl］-isonitrile和Benzene，4-pentynyl（表1）。

以茶皂素作为桔青霉生长的唯一碳源，将茶皂素中原有的成分通过桔青霉自身的新陈代谢和酶解作用，转变为新的物质，改变了其原有的一些成分，对茶皂素的降解有着积极的作用。新生成的物质为苯丁基炔和1-甲基-2-对苯乙基腈，炔烃可以发生加成、取代、聚合、消去及氧化反应；腈类物质在酸性或者碱性环境中水解为酰胺或者羧基，与格利雅试剂加成、水解生成酮，还原成一级胺。

4　结 论

油茶是我国南方重要的山茶科植物，油茶粕主要用作为饲料，本文利用桔青霉来降解油茶粕中的茶皂素，不仅工艺简单、无二次污染，而且节约了经济成本，减少了环境污染。茶皂素为桔青霉的生长提供了必要的碳源，促进了菌体生长，发酵后发酵液中的各种成分含量与发酵前相比有较大程度的下降，说明桔青霉对茶皂素有较强的降解能力。通过桔青霉对茶皂素降解的单因素实验研究得到最佳条件为：培养时间13 d，培养温度31℃，摇床转速150 r/min，接种量6 mL。在此条件下，茶皂素的降解率达到了36.71%，对茶皂素的降解有着重要的现实意义。

表1　桔青霉发酵后生成的新物质Table 1 Degradation products of Penicillium citrinum

［1］齐小健，彭瑞福.从油茶饼中提取皂素［J］.化学世界，1989（6）：275-277.

［2］邓元荣，卓仪荣，王玲.油茶皂苷的体外溶血试验研究［J］.海峡药学，2008，20（12）：29-32.

［3］罗毅志，叶雪平，施伟达.茶皂素对部分常见淡水水生生物的毒性试验［J］.淡水渔业，2004，34（1）：10-12.

［4］王元凤，俞兰，魏新林.从油茶饼粕中提取油茶籽多糖和茶皂素的工艺研究［J］.食品工业，2008（6）：29-32.

［5］宋威，张芹，李欢庆，等.复合载体固定化细胞发酵生产核酸酶P1的对比研究［J］.河南工业大学学报：自然科学版，2008，29（3）：51-54.

［6］梁剑光，黄鹏，徐正军.桔青霉发酵法生产核酸酶P1工艺条件及影响因素研究 ［J］.中国酿造，2007（11）：27-30.

［7］王端好，周河治，张小里.桔青霉生产核酸酶的发酵条件研究［J］.生物加工过程，2008，6（2）：33-37.

Degradation of tea saponin by Penicillium citrinum

HUANG Pu，XIAO Yu，LIU Yi-qing，QIN Yan，CHEN Ju-qing，YANG Sen
（a.Guangxi Talent Highland for Hazard and Waste Disposal Industrialization；b.Guangxi Mining and Environmental Sciences Laboratory Center，Guilin University of Technology，Guilin 541004，China）

Tea saponin is an important component in oil tea cake，a major influence on oil tea cake as aninal feeding utilization.In order to get the Penicillium citrinum degradation of tea saponin in the best fermentation condition the fermentation was studied before and after.The tea saponin standard was liquid fermentation degradated by Penicillium citrinum according to the degradation rate of tea saponin.The optimum fermentation conditions were determined by single factor，such as time，fermentation temperature，rotate speed and inoculum size，etc.The optimum fermentation degradation conditions were studied by time 13 d，fermentation temperature 31℃，rotating speed 150 r/min and inoculum size 6 mL etc.Under the control of the optimum fermentation degradation conditions，the decomposition rate of tea saponin was 36.71%.Finally，the produsts before and after being fermented are analyzed by GC-MS.

oil tea cake；tea saponin；Penicillium citrinum；liquid fermentation

X5

A

1674-9057（2016）03-0592-05

10.3969/j.issn.1674-9057.2016.03.028

2014-12-04

国家自然科学基金项目（21367010）

黄 浦 （1989—），硕士，研究方向：固体废物处理与资源化，1096558202@qq.com。

肖 瑜，博士，教授。

引文格式：黄浦，肖瑜，刘以清，等.桔青霉降解茶皂素的实验研究［J］.桂林理工大学学报，2016，36（3）：592-596.