TM7SF4对人甲状腺乳头状癌细胞IHH-4增殖、凋亡和侵袭的作用研究

周秦毅 陈隽 冯嘉麟 王家东

·论著·

TM7SF4对人甲状腺乳头状癌细胞IHH-4增殖、凋亡和侵袭的作用研究

周秦毅 陈隽 冯嘉麟 王家东

目的探讨树突表达特异性7跨膜蛋白(TM7SF4)的低表达对人甲状腺乳头状癌细胞IHH-4增殖、凋亡和侵袭的作用及其相关机制。方法选取甲状腺乳头状癌患者的手术标本(癌组织及癌旁组织)及甲状腺乳头状癌细胞系IHH-4为对象。qRT-PCR法检测病理组织和细胞系IHH-4中TM7SF4的mRNA表达量。分别用MTT法、流式细胞分析和Transwell法检测TM7SF4表达量对IHH-4细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。Western印迹检测IHH-4细胞中磷酸化与非磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕酶素靶蛋白(mTOR)的表达。结果与癌旁组织相比，甲状腺癌组织中TM7SF4的mRNA表达水平显著升高(t=52.31，P<0.05)。与正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1相比，IHH-4细胞系中TM7SF4的表达水平也显著上升(t=34.35，P<0.05)。与对照组细胞相比，沉默TM7SF4的表达后，可诱导IHH-4细胞凋亡，而细胞增殖和侵袭能力受到显著抑制(F=8.32，7.55，846.40；P均<0.05)。此外，沉默TM7SF4的表达后可显著降低磷酸化PI3K、磷酸化Akt、磷酸化mTORmRNA及蛋白的表达(F=1 014.88，1 121.29，985.22，720.14，854.63，4 563.12；P均<0.05)。结论低表达的TM7SF4可能通过下调PI3K/Akt/mTOR通路而抑制IHH-4细胞增殖、诱导凋亡并抑制侵袭。

甲状腺乳头状癌；树突表达特异性7跨膜蛋白；细胞增殖；细胞凋亡；细胞侵袭

甲状腺癌是一种起源于甲状腺的常见恶性肿瘤，近年来的发病率呈增加趋势[1]。分化型甲状腺乳头状癌(PTC)是甲状腺癌多种临床分型中最主要的分型，其发病率较高，占所有甲状腺癌的80%左右[2-3]。已有报道表明化学治疗、放射治疗和手术切除是PTC的常规治疗方法，但由于其发病机制复杂，各类治疗效果都不够理想[4-5]。近年来，很多研究致力于PTC的致病基因研究，以期从分子角度找到治疗甲状腺癌的有效手段。

树突表达特异性7跨膜蛋白(Dendrocyte Expressed Seven Transmembrane Protein，DCSTAMP；又名Transmembrane 7 Superfamily Member 4，TM7SF4)是一种由TM7SF4基因编码的主要存在于树突状细胞内的7次跨膜蛋白，参与细胞融合、细胞分化和免疫稳态等生物学过程[6]。前期报道证明TM7SF4在人破骨细胞发生、融合与再吸收和骨Paget病等中发挥关键作用[7-8]。但在甲状腺癌中的报道却很少。目前，已有学者利用生物信息学方法预测到TM7SF4在甲状腺癌组织中的表达会发生异常[9-10]。新近研究中，Lan等[11]利用基因组测序法检测到TM7SF4在PTC组织中的表达量显著增加。但尚未有研究证明TM7SF4与PTC发病机制的关系。本研究利用人PTC细胞系IHH-4，研究了TM7SF4基因在该细胞系中的作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 病例样本信息、细胞培养 选取2013年9月至2015年1月在上海交通大学医学院附属仁济医院入院并被诊断为PTC的32对病理及其癌旁组织作为实验材料。PTC病理组织及邻近正常组织置于-80℃中保存备用。PTC细胞株IHH-4及正常细胞株Nthy-ori 3-1(购自中国科学院上海细胞生物研究所)置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在 37℃，5%CO2的条件下培养。本研究已被上海交通大学医学院附属仁济医院伦理道德委员会批准，所有患者都知情同意。

1.2 材料 RPMI-1640培养基、胎牛血清、抗生素G418、TM7SF4抗体和磷酸化与非磷酸化的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕酶素靶蛋白(mTOR)抗体均购自美国Sigma公司；pcDNA3.1过表达载体和siRNA沉默载体购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Lipofectamine 2000、细胞MTT增殖试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒与Transwell小室购自美国Invitrogen公司；qRT-PCR试剂盒和蛋白浓度检测试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 细胞转染 将浓度为5×107/L的IHH-4细胞接种于6孔板中，培养24 h后(细胞贴壁生长)，按照Lipofectamine 2000试剂盒的操作步骤进行细胞转染。用10 μl的Lipofectamine 2000包被4 μg质粒(含TM7SF4编码序列的沉默siRNA载体或过表达pcDNA-TM7SF4载体)转入IHH-4细胞。6～8 h后更换新鲜的含抗生素G418的RPMI-1640培养基进行后续培养。转入的空siRNA载体作为对照组。

1.4 MTT法检测细胞增殖 按照MTT试剂盒操作步骤检测TM7SF4基因沉默或过表达对细胞增殖的影响。转入不同类型载体的细胞经过抗生素筛选并继续培养24 h后，将该细胞接种于96孔板上并用新鲜培养基稀释至细胞浓度为2×105个/孔。在不同观察时间点，每孔加入10 μl MTT，将细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中继续培养4 d。在波长为450 nm处测定吸光度A值，然后以时间为横坐标，A值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.5 流式细胞法检测细胞凋亡 用流式细胞法检测TM7SF4基因沉默或过表达对细胞凋亡的影响。将1 ml的IHH-4培养液平铺到24孔板上并调节细胞浓度约至1×105个/孔。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养至对数生长期，然后用胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，于12 000 g离心5 min收集细胞体。接着调整细胞浓度为1×109个，使用凋亡试剂盒进行避光染色，染色1 h后在流式细胞仪上进行检测。计算活细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率。细胞总凋亡率(%)=早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)。

1.6 Transwell检测细胞侵袭 用Transwell法检测TM7SF4基因沉默或过表达对细胞侵袭的影响。取对数期的IHH-4细胞用无血清的RPMI-1640培养基稀释制成浓度为1×109/L的单细胞悬液。用100 μl/孔上室凝胶液(融化的Matrigel原液和预冷的RPMI-1640培养基混合液)包被24孔板的Transwell上室，37℃下放置2 h使其凝固。每孔加入200 μl IHH-4单细胞悬液。将500 μl含血清的RPMI-1640培养基加入 Transwell下室，置于含 5% CO2的培养箱中培养。48 h后，取出Transwell小室，去除液体培养基，用PBS缓冲液漂洗后置于4%的甲醛中固定15 min， PBS漂洗 2 min，结晶紫染色 5 min。于400倍显微镜下观察并计数(选取5个视野计算平均值)。

1.7 qRT-PCR检测TM7SF4基因及细胞凋亡信号通路蛋白PI3K、Akt和mTOR mRNA的表达用Trizol法从甲状腺癌组织及IHH-4细胞系中分别提取总RNA，具体操作参照试剂盒说明书。提取的总RNA经过RNse-free Dnase Ⅰ处理后，用紫外分光光度计检测纯度和浓度。用不含核酸降解酶的双蒸水调节RNA浓度为0.5 μg/μl，作为cDNA合成的模板，具体操作参照PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒。参考SYBR ExScript RT-qPCR Kit试剂盒操作步骤进行目的基因的扩增，反应体系为20 μl(1 μl cDNA, 10 μl SYBR Premix EX Taq, 1 μl primer, 7 μl ddH2O)。PCR反应程序为：50℃预变性2 min； 95℃变性10 min；退火10 s，60℃延伸1 min，45个循环。2-△△Ct表示mRNA的表达水平。选择GAPDH作为内参(表1)。

1.8 Western印记检测TM7SF4蛋白及细胞凋亡信号通路蛋白PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化和非磷酸化的表达 收集培养24 h后的IHH-4细胞溶解于RIPA裂解液中，于4℃下以12 000 g离心5 min。收集离心后上清以获得总蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测总蛋白浓度。将50 μg的总蛋白上样至12%的聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳后将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，置于含5%牛血清蛋白的TBST缓冲液中室温下封闭1 h。然后加入兔抗人一抗(TM7SF4，磷酸化PI3K，磷酸化Akt，磷酸化mTOR，1∶100)4℃下过夜孵育。加入二抗(1∶1 000)室温下孵育1 h。ECL检测蛋白条带。选择GAPDH作为内参。

1.9 统计学处理 本研究中所有实验均重复3次。正态分布的计量数据采用均数±平均标准误，所有数据均用Graph Prism 5.0软件进行统计分析。两组间差异性统计分析采用独立样本t检验法，多组间比较采用方差分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TM7SF4对IHH-4细胞增殖的影响 与对照组相比，当IHH-4细胞转入pcDNA-TM7SF4载体时，细胞活力(OD值)随培养时间增加而显著升高(F=6.62，P<0.05)。但是当IHH-4细胞转入si-TM7SF4载体时，细胞活力随着培养时间增加而显著下降(F=8.32，P<0.05，图1)。

注：Control：转入siRNA空载体的IHH-4细胞；pc-TM7SF4：转入pcDNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞；si-TM7SF4：转入siRNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞；TM7SF4：树突表达特异性7跨膜蛋白；与对照组相比，aP<0.05图1 TM7SF4对IHH-4细胞增殖能力的影响

2.2 TM7SF4对IHH-4细胞凋亡的影响 与对照组相比，转入pcDNA-TM7SF4的细胞凋亡率没有显著变化(6.20%vs. 4.04%)，而转入si-TM7SF4的IHH-4细胞凋亡百分数显著升高(15.5%，F=6.87，P<0.05)，而且同时转入沉默和过表达载体后的IHH-4细胞凋亡百分数(5.15%)与对照组相比没有显著差异(图2A，2B)。

表1 qRT-PCR引物序列及产物

注：TM7SF4: 树突表达特异性7跨膜蛋白；PI3K: 磷脂酰肌醇3激酶；Akt：丝/苏氨酸蛋白激酶；mTOR: 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；GAPDH: 磷酸甘油醛脱氢酶

注：A：流式细胞分析法检测各组细胞凋亡结果;si-NC:转入siRNA空载体的IHH-4细胞；pc-TM7SF4:转入pcDNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞；si-TM7SF4:转入siRNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞；TM7SF4：树突表达特异性7跨膜蛋白；B：各组细胞凋亡的百分数;与对照组相比, aP<0.05图2 TM7SF4对IHH-4细胞凋亡的影响

注：A: 与甲状腺癌旁组织相比，TM7SF4在乳头状甲状腺癌组织中的相对mRNA表达水平；B：TM7SF4在甲状腺癌细胞系IHH-4和正常细胞系Nthy-ori-3-1中的相对mRNA水平，与对照组(正常细胞系Nthy-ori-3-1)相比，aP<0.05；C-D：TM7SF4沉默与过表达后在不同组中的mRNA和蛋白水平检测；si-NC：转入siRNA空载体的IHH-4细胞；pc-TM7SF4：转入pcDNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞；si-TM7SF4：转入siRNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞；PTC：甲状腺乳头状癌；GAPDH：三磷酸甘油醛脱氢酶；与对照组相比，aP<0.05；TM7SF4：树突表达特异性7跨膜蛋白图4 TM7SF4在PTC病理组织及IHH-4细胞系中的表达

2.3 TM7SF4对IHH-4细胞侵袭的影响 与对照组相比，转入pcDNA-TM7SF4的IHH-4细胞侵袭的数目显著增加，而转入siRNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞侵袭的数目显著下降(F=846.40，P<0.01)。同时转入沉默和过表达载体的组中，侵袭细胞数目与对照组相比没有显著性差别(图3A，3B，封3)。

2.4 TM7SF4在甲状腺癌组织和细胞系中的表达

qRT-PCR方法检测TM7SF4在PTC组织和癌旁临近正常组织中的表达水平(图4A)。与临近正常组织相比，TM7SF4在癌组织中的表达显著上升(t=52.31，P<0.01)。与正常细胞株Nthy-ori-3-1相比，TM7SF4在IHH-4细胞系中的表达量显著上升(t=34.35，P<0.01)，见图4B。分别构建TM7SF4基因沉默和过表达载体并转入IHH-4细胞系中(图4C, 4D)。与对照组相比，转入siRNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞中的TM7SF4相对mRNA和蛋白表达量显著下降，而转入pcDNA-TM7SF4的IHH-4细胞中其相对mRNA和蛋白表达量显著升高(F=49.00，42.25，P均<0.05)。当沉默和过表达载体同时转入IHH-4细胞中时，TM7SF4的mRNA和蛋白表达量与对照组相比没有显著性差异。

2.5 TM7SF4基因沉默对细胞凋亡信号通路的影响 与对照组相比，当IHH-4细胞转入pcDNA-TM7SF4过表达载体时，磷酸化的PI3K、Akt和mTOR的相对mRNA和蛋白表达水平均显著升高，但当细胞转入si-TM7SF4载体时，磷酸化的PI3K、Akt、mTOR的相对mRNA和蛋白表达水平均显著下降(F=1 014.88，1 121.29，985.22，720.14，854.63，4 563.12；P均<0.05；图5A, 5B)。同时转入沉默和过表达载体的细胞中，磷酸化的因子水平则与对照组没有显著性差异。

3 讨论

利用生物信息学方法预测TM7SF4在甲状腺癌中发生异常表达[9-10]。但关于TM7SF4对PTC细胞生物学过程的影响及其生物学机制未见报道。只有Nikolova等[10]采用生物信息预测法和RT-PCR法报道了TM7SF4在甲状腺癌发生中高表达，可能是甲状腺癌发生的一个重要靶基因。本研究结果显示，TM7SF4在PTC组织和IHH-4细胞系中表达量显著上升(P<0.05)，与前期研究结果一致[10- 11]。表明TM7SF4与PTC的发病存在密切关系。

注：PI3K：磷脂酰肌醇3激酶；p-PI3K：磷酸化PI3K；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化Akt；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；p-mTOR：磷酸化mTOR；A: 经过不同TM7SF4表达水平处理后，p-PI3K，p-Akt和p-mTOR的相对mRNA表达水平；与对照组相比，aP<0.05；bP<0.01；B：不同处理组中p-PI3K，p-Akt和p-mTOR的蛋白表达水平；si-NC:转入siRNA空载体的IHH-4细胞；pc-TM7SF4:转入pcDNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞；si-TM7SF4:转入siRNA-TM7SF4载体的IHH-4细胞；TM7SF4：树突表达特异性7跨膜蛋白图5 TM7SF4对IHH-4细胞PI3K/Akt/mTOR mRNA及蛋白表达的影响

已有研究证实细胞增殖、凋亡和侵袭与肿瘤的发生、发展和转移密切相关[12-14]。前期研究证明TM7SF4在骨形成或骨炎性反应相关疾病中都呈高表达，但在肿瘤中的作用报道较少[15-16]。在Tu等[17]研究中，TM7SF4高表达通过促进细胞增殖与侵袭，参与前列腺癌的骨转移。Kim等[9]采用基因组测序的方法证明了TM7SF4参与PTC的细胞凋亡、转移和侵袭。本研究结果显示TM7SF4低表达(基因沉默后)可以显著抑制IHH-4细胞增殖和侵袭并诱导细胞凋亡，因此推测低表达的TM7SF4可能在PTC的发生、发展和转移中起抑制作用。

PI3K/Akt/mTOR信号通路参与多种肿瘤的发生和发展[18-20]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，而Akt是其下游关键蛋白[21]。PI3K/Akt/mTOR被激活时可以转变为磷酸化的PI3K/Akt/mTOR，Akt能够导致肿瘤的发生、发展和侵袭。mTOR可以直接或间接被磷酸化Akt激活而发生磷酸化，进而促进细胞增殖和凋亡，在肿瘤发生中起促进作用[22]。另一方面，Santarpia等[23]证明在甲状腺癌中，Akt被激活后，可以促进甲状腺癌细胞的增殖和凋亡，进而促进肿瘤的发展。同时，Miyakawa等[24]研究证明，磷酸化Akt在PTC组织中的表达量显著上升，而且100%的PTC中都能检测到高表达水平的磷酸化Akt。与前人研究结果一致，本研究中TM7SF4高表达时，磷酸化PI3K、磷酸化Akt和磷酸化mTOR的水平都显著上升。然而，当TM7SF4基因表达被沉默时，上述3种因子的磷酸化水平则显著下降，表明低表达的TM7SF4参与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活。

本研究表明，TM7SF4低表达可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活进而抑制PTC细胞增殖、诱导凋亡并抑制其侵袭。TM7SF4可能是PTC的一个潜在治疗靶点，但其具体机制及其临床应用潜在能力尚有待进一步研究。

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EffectsofTM7SF4onproliferation,apoptosisandinvasionofhumanpapillarythyroidcancerIHH-4cells

ZhouQinyi,ChenJun,FengJialin,WangJiadong.

DepartmentofHeadandNeckSurgery,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200001,China

Correspondingauthor:WangJiadong,Email:drjiadongw@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of dendrocyte expressed seven transmembrane protein (TM7SF4) on proliferation, apoptosis and invasion of human papillary thyroid cancer (PTC) cell IHH-4.MethodsPTC tumor tissues and the adjacent normal tissues, as well as the human PTC IHH-4 cells were used in this study. TM7SF4 mRNA in tissues and in IHH-4 cells were analyzed using qRT-PCR analysis. The effects of TM7SF4 on proliferation, apoptosis and invasion of IHH-4 cells were analyzed using MTT assay, flow cytometry and Transwell assay, respectively. Furthermore, Western blotting was used to detect the expression of TM7SF4，phosphorylated and non-phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), protein kinase B (Akt), mammalian target of rapamycin (mTOR) protein.ResultsCompared with adjacent normal tissues, TM7SF4 mRNA and protein were significantly increased IHH-4 in PTC tissues (t=52.31,P<0.05). TM7SF4 was also significantly increased in cells compared with that in Nthy-ori 3-1 cells (t=34.35,P<0.05). Consequently, silencing TM7SF4 significantly induced IHH-4 cells apoptosis, inhibited proliferation and suppressed invasion compared with controls (F=8.32, 7.55， 846.40；allP<0.05). Moreover, the mRNA and protein levels of phosphorylated-PI3K, phosphorylated-Akt and phosphorylated-mTOR were significantly decreased by silencing TM7SF4 (F=1 014.88，1 121.29，985.22，720.14，854.63，4 563.12, allP<0.05).ConclusionDown-regulated TM7SF4 may be an inhibitor of PTC development and metastasis through suppressing PI3K/Akt/mTOR pathway.

Papillary thyroid cancer; Dendrocyte expressed seven transmembrane protein; Cell proliferation; Cell apoptosis; Cell invasion

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.04.08

200001 上海交通大学医学院附属仁济医院头颈外科

王家东，Email: drjiadongw@aliyun.com

2015-08-29)