HPLC法测定八角枫药材不同药用部位中L（-）-八角枫碱的含量

王其勇，许亚玲（贵州省食品药品检验所，贵阳　550004）

HPLC法测定八角枫药材不同药用部位中L（-）-八角枫碱的含量

王其勇＊，许亚玲#（贵州省食品药品检验所，贵阳550004）

目的：建立测定八角枫药材不同药用部位（茎、根茎、须根及支根）中L（-）-八角枫碱含量的方法，为八角枫药材的开发利用提供参考。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Thermo C18，流动相为甲醇-磷酸缓冲液（22∶78，V/V），流速为1.0 ml/min，检测波长为259 nm，柱温为30℃，进样量为10 μl。结果：L（-）-八角枫碱的进样量线性范围为0.020 62～0.257 80 μg（r=0.999 9）；定量限为1.7 ng，检测限为0.5 ng；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2%；加样回收率为97.38%～98.86%（RSD=0.6%，n=6）。不同药用部位中L（-）-八角枫碱含量，须根＞支根＞根茎＞茎。结论：该方法操作简便、结果准确、重复性好、专属性强，适用于测定八角枫药材不同药用部位（茎、根茎、须根及支根）中L（-）-八角枫碱的含量。

高效液相色谱法；八角枫；L（-）-八角枫碱；不同药用部位

八角枫收载于2003年版《贵州省中药材及民族药材质量标准》，为八角枫科植物八角枫Alangium chinense（Lour.）Harms及瓜木Alangium platani f olium（Sieb.Et Zucc.）Harms的干燥细须根（白龙须）或干燥支根（白金条）［1］，而2015年版《中国药典》未收载该药材。八角枫药材生于280～1 800 m的山地或疏林中，喜温暖潮湿气候，分布于河南、陕西、甘肃、西藏南部、云南、四川、湖南、湖北、广西、广东、江西、江苏、浙江、福建、台湾、贵州等省区，全年均可采挖［2］。其在贵州全省均有分布，为贵州省少数民族用药，具有祛风通络、散瘀镇痛、麻醉及松弛肌肉等功效［3-5］，可用于治疗风湿疼痛、麻木瘫痪、心力衰竭、劳损腰痛、跌打损伤等证。其须根含生物碱（即八角枫碱），是松弛肌肉的主要活性成分，也是其毒性的主要来源［6-8］。八角枫药材传统以须根入药，其他部位（支根、根茎、茎等）几乎不用，这对其资源造成了极大的浪费。如果其他部位也含有八角枫碱，那么这些部位就能和须根一样入药使用，从而提高八角枫药材的使用率。笔者查阅相关文献［9-14］，发现除须根外，均未有其他部位的分析研究以及有效成分测定的报道。因此，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）对八角枫药材不同药用部位进行测定，以期为八角枫药材的开发利用提供参考。

1　材料

1.1仪器

UltiMate 3000型HPLC仪，配有四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、变色龙色谱处理系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）；240型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2试剂

L（-）-八角枫碱对照品［阿法埃莎（天津）化学有限公司，批号：10110058，纯度：94.0%］；甲醇（美国Tedia公司）为色谱纯，三氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司）、庚烷磺酸钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、冰乙酸（天津市富宇精细化工有限公司）、磷酸二氢钾（天津市致远化学试剂有限公司）为分析纯，水为自制超纯水。

1.3药材

本试验共收集到10批样品（样品信息见表1），均产于贵州省毕节地区织金县，并由贵阳中医学院陈德媛研究员鉴定为八角枫Alangium chinense（Lour.）Harms的干燥细须根、支根、根茎、茎。

表1　八角枫药材10批样品信息Tab 1　Information of 10batches of samples ofA.chinense

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Thermo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-磷酸缓冲液（0.2 g庚烷磺酸钠、2.0 g磷酸二氢钾、0.3 ml磷酸置于1 000 ml量瓶中，加水定容，摇匀）（22∶78，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：259 nm；柱温：30℃；进样量：10 μl。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液精密称取L（-）-八角枫碱对照品10.97 mg，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取上述贮备液5 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为10.31 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液取样品粉末（过四号筛）适量，约0.5 g，精密称定，置于100 ml锥形瓶中，精密量取酸性甲醇溶液（取甲醇30 ml，用5%乙酸溶液稀释至100 ml）25 ml，称定质量，置水浴上回流提取30 min，放冷，用酸性甲醇溶液补足减失的质量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液取“2.2.2”项下酸性甲醇溶液作为阴性对照溶液。

2.3系统适用性与专属性试验

精密量取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以L（-）-八角枫碱峰计为6 500；保留时间为13.32 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1　高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.L（-）-八角枫碱Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.L（-）-Anabasine

2.4线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下对照品溶液2、5、10、15、20、25 μl，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得L（-）-八角枫碱的回归方程为y=966 993.714 6x+544.252 9（r=0.999 9）。结果表明，L（-）-八角枫碱的进样量线性范围为0.020 62～0.257 80 μg。

2.5定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限为1.7 ng；当信噪比为3∶1时，得检测限为0.5 ng。

2.6精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，L（-）-八角枫碱峰面积的RSD=0.4%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：20120601）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，L（-）-八角枫碱峰面积的RSD=0.2%（n= 7），表明供试品溶液在室温下12 h内稳定性良好。

2.8重复性试验

取样品（批号：20120601）粉末适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算平均含量。结果，L（-）-八角枫碱的平均含量为1.254 4 mg/g，RSD=1.2%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9加样回收率试验

取样品（批号：20120601）粉末适量，共6份，每份约0.25 g，精密称定，置于100 ml锥形瓶中，精密加入一定质量的L（-）-八角枫碱对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果详见表2。

表2　加样回收率试验结果（n=6）Tab 2　Results of recovery test（n=6）

2.10样品含量测定

分别取10批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算L（-）-八角枫碱的含量，结果详见表3。

表3　样品含量测定结果（n=2，%）Tab 3　Results of content determination of sample（n=2，%）

3　讨论

3.1提取溶剂的选择

取甲醇、三氯甲烷以及酸性甲醇溶液各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，酸性甲醇溶液作为提取溶剂时，色谱峰峰形较好，主峰与相邻峰的分离度＞1.5，且L（-）-八角枫碱的含量最高。因此，本试验选择酸性甲醇溶液为提取溶剂。

3.2各部位八角枫碱的含量比较

八角枫药材所含生物碱以L（-）-八角枫碱为主，通过本试验表明该药材各部位均含有L（-）-八角枫碱，含量依次为须根＞支根＞根茎＞茎，其中须根为0.95%，支根为0.13%，根茎为0.030%～0.040%，茎为0.016%～0.018%。但是，须根是毒性最大的部位，会引起中毒情况，因此可降低须根的使用量，而增加支根和根茎的用量，这既可保证疗效，又可减少使用该药材而导致的中毒情况［15］。

3.3合理的开发利用

目前，对八角枫药材须根的研究报道较多，比如对水杨苷、生物碱的含量测定，毒理以及临床应用等，但是对其他部位（支根、根茎、茎等）的研究报道较少，这与八角枫药材的传统用药方式有关。该药材主要以野生为主，传统以须根入药，其余部位几乎很少使用。近年来，八角枫药材在贵州省中成药中的应用逐渐增多，随着使用量的增加，其野生资源也越来越少，而单用其他部位入药又达不到相应的疗效，造成其他部位药材使用率较低，形成资源浪费。因此，打破用药常规，合理的利用支根、根茎等药用部位，将各部位配合使用以缓解须根资源不足很有必要。八角枫药材在贵州以野生为主，四季均可采挖，不同产区及采收期收集的药材其质量会有不同，由于本试验收集的样品有限，给出的试验数据未能全面反映该药材的质量情况，因此进一步对生长环境、采收季节、产地加工等影响药材质量的因素进行考察很有必要。

综上所述，本方法操作简便、结果准确、重复性好、专属性强，适用于测定八角枫药材不同药用部位（茎、根茎、须根及支根）中L（-）-八角枫碱的含量。

［1］贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准［S］.贵阳：贵州科技出版社，2003：11.

［2］鲍家科.贵州省中药及民族药材质量原植（动）物彩色图鉴：上［M］.贵阳：贵州科技出版社，2009：8.

［3］全国中草药汇编组.全国中草药汇编：上［M］.北京：人民卫生出版社，1982：14.

［4］南京中医药大学.中药大辞典：上册［M］.2版.上海：上海科学技术出版社，2006：32-34.

［5］浙江医科大学.八角枫碱肌肉松弛作用的研究［J］.新医药学杂志，1974（10）：45.

［6］杨仓良.毒药本草［M］.北京：中国中医药出版社，1993：172.

［7］张昌华，王登文，许小明，等.八角枫中毒死亡1例［J］.法医学杂志，2008，24（2）：155.

［8］张长银，张礼俊，胡永良，等.小鼠急性八角枫中毒的病理学观察［J］.法医学杂志，2009，25（5）：329.

［9］刘毅，张丽艳，张永萍，等.高效液相色谱法测定黔产民族药材八角枫中毒藜碱的含量［J］.中国医院药学杂志，2009，29（11）：962.

［10］石钺，杨帅，李开通.高效液相色谱法测定风湿定胶囊中毒藜碱的含量［J］.中国医院药学杂志，2009，29（1）：87.

［11］梁从庆，李书渊，房志坚.HPLC法测定风湿定片中毒藜碱的含量［J］.中药新药与临床药理，2004，15（4）：268.

［12］张化为，崔春利，宋逍，等.风湿定胶囊中毒藜碱限量测定［J］.陕西中医，2007，28（9）：1 232.

［13］戚宝婵，康强，李子，等.HPLC法测定养阴清肺丸中芍药苷的含量［J］.中国药房，2012，23（32）：3 053.

［14］许亚玲，罗曼，周兰，等.RP-HPLC法测定小建中片中桂皮醛的含量［J］.中国药房，2012，23（32）：3 044.

［15］王其勇，许亚玲，钟宏波.八角枫不同药用部位的高效液相指纹图谱测定［J］.贵州农业科学，2015，43（2）：133.

（编辑：刘柳）

Content Determination of L（-）-Anabasine in Different Medicinal Parts ofAlangium chinense by HPLC

WANG Qiyong，XU Yaling（Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of L（-）-Anabasine in different medicinal parts（stem，rhizome，fibrous root，rootlet）of Alangium chinense，and provide reference for its development and utilization.METHODS：HPLC was performed on the column of Thermo C18with mobile phase of methanol-phosphate buffer solution（22∶78，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 259 nm，column temperature was 30℃；the injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range of L（-）-Anabasine was 0.020 62-0.257 80 μg（r=0.999 9）；the limit of quantitation was 1.7 ng，limit of detection was 0.5 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 97.38%-98.86%（RSD=0.6%，n=6）.The content of L（-）-Anabasine in different medicinal parts was the fibrous root＞the rootlet＞the rhizome＞the stem.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，reproducible and specific，and suitable for the content determination of L（-）-Anabasine in different medicinal parts（stem，rhizome，fibrous root，rootlet）of A.Chinense.

HPLC；Alangium chinense；L（-）-Anabasine；Different medicinal parts

R917

A

1001-0408（2016）27-3877-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.45

＊副主任药师。研究方向：药物分析。电话：0851-86807025。E-mail：qiyoo_king@sina.com

主任药师。研究方向：药物分析。电话：0851-86808035。E-mail：499929857@qq.com

（2015-10-29

2016-07-07）