抗鸡lgMµ链单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

赵 莉柯 浩步志高鲍恩东*

（1.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095；2.中国农科院哈尔滨兽医研究所国家重点实验室生物技术六室，黑龙江哈尔滨 150001；3.丹阡市农业委员会，江苏丹阡 212300）

抗鸡lgMµ链单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

赵 莉1，2，3柯 浩1步志高2鲍恩东1*

（1.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095；2.中国农科院哈尔滨兽医研究所国家重点实验室生物技术六室，黑龙江哈尔滨 150001；3.丹阡市农业委员会，江苏丹阡 212300）

以原核表达鸡IgM µ链蛋白免疫BALB/c小鼠，取3次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经ELISA筛选克隆，获得2株分泌抗鸡IgM µ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1H2、1D10）。这2株杂交瘤细胞株连续传代4个月，并经液氮冻存5个月后复苏培养，仍能稳定地分泌特异性McAb。1H2、1D10腹水ELISA效价分别为1：106、1：107，亚类鉴定均为IgG1κ型。间接ELISA检测显示，这两株单抗均与鸡血清中的天然IgM发生特异性反应，可用于鸡血清中IgM的快速检测，对于各种传染病的早期诊断具有重要意义。

原核表达鸡IgM µ链蛋白 单克隆抗体 鸡血中的天然IgM

IgM是机体初次体液免疫应答中最早出现的免疫球蛋白，其在血清中的含量会在首次接触抗原的几天内达到高峰，然后通过免疫球蛋白类转换作用转变为IgG而使其含量逐渐下降［1-2］。由于记忆B细胞并不大量分泌IgM，所以IgM的升高预示近期机体内有抗原出现。因此IgM在动物疾病的早期诊断方面发挥着重要作用。由于目前各类传染病危害严重，迫切需要一种有效的早期诊断试剂进行快速诊断以控制病情，淘汰感染畜禽，减少损失。为此，本试验利用原核表达鸡IgM μ链蛋白免疫BALB/c小鼠，以期获得能够稳定分泌抗鸡IgM μ链单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）的杂交瘤细胞株，为进一步建立快速灵敏的抗鸡IgM μ链诊断试剂盒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 6周龄健康雌性的BALB/c小鼠 购自北京维通利华实验动物公司。

1.1.2 细胞株和免疫原 SP2/0骨髓瘤细胞株和大肠杆菌表达的鸡IgMμ链蛋白 均由中国农科院哈尔滨兽医研究所生物技术六室提供。

1.1.3 主要试剂 RPMI1640培养基购自GiBco公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG4000、HT、HAT、酶标二抗均购自Sigma公司；IgG抗体亚类试剂盒购自Southern Biotech公司；Hyclone血清购自Hyclone公司；Toyopearl HW-55凝胶层析柱填料购自北京惠德易科技有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物免疫 选取6只健康雌性的BALB/c小鼠，以鸡IgM μ链蛋白免疫4次。免疫方式为腹腔和后腿肌肉注射，免疫剂量为10 μg/只，免疫间隔为3周，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原，第2、3次免疫用弗氏不完全佐剂乳化抗原，第4次直接腹腔注射加强免疫，3d后取脾进行细胞融合［3］。

1.2.2 饲养细胞制备 融合前一天，取8周龄健康BALB/c小鼠一只，拉颈处死，75%酒精中浸泡5 min后，将10 ml不完全1640培养液无菌注入小鼠腹腔，轻揉2 min，然后吸出已含腹腔巨噬细胞的培养液，1000 rpm /min离心10 min；弃上清，用HAT培养液调整细胞密度至2×105个细胞/ml；加至96孔板（100 μl/孔），置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。

1.2.3 SP2/0骨髓瘤细胞制备 用不完全1640培养液收集处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞，1000 rpm/min离心10 min；弃上清，用不完全1640培养液悬浮沉淀，计数备用。

1.2.4 免疫鼠脾细胞的制备 取免疫小鼠一只，摘眼球采血并处死；无菌取脾，去除脂肪和被膜，在不完全1640培养液中用剪刀剪碎，200目铜网过滤，收集脾细胞，1000 rpm/min离心10 min；弃上清，用不完全1640培养液悬浮沉淀，计数备用。

1.2.5 细胞融合 按常规方法［4］进行。将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞按1：5的比例混匀于融合管中，1000 rpm/min离心10 min；弃上清，轻拍融合管底部，使两种细胞均匀分散；在1 min内加入1 ml 37℃预热的融合剂，随即由慢到快加入20 ml不完全1640培养液终止融合反应，室温静置20 min；1000 rpm/min离心10 min；弃上清，用HAT培养液轻轻悬浮，加至铺有饲养细胞的96孔培养板中（100 μl/孔），置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。

1.2.6 阳性杂交瘤细胞株的筛选及McAb化 采用常规饱和硫酸铵盐析法从鸡血清中获得IgM粗提制品，再用Toyopearl HW-55凝胶层析柱分离纯化［5-6］，以纯化的天然IgM作为包被抗原，间接ELISA检测细胞培养上清，筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞。阳性孔采用有限稀释法连续进行亚克隆筛选，直至克隆细胞生长孔均为阳性为止。选取McAb阳性孔，扩增培养，液氮中冻存。

1.2.7 McAb抗体的亚型鉴定 按试剂盒操作说明，利用间接ELISA法，以杂交瘤细胞上清作为一抗，分别以酶标抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA以及酶标抗κ、λ为二抗进行亚型鉴定。

1.2.8 腹水制备及效价测定 将0.5 ml无菌弗氏不完全佐剂注射到10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔；一周后再注入1.5×106个杂交瘤细胞；7～10 d后，当小鼠腹部明显膨胀时抽取腹水，1500 rpm /min离心10 min，除去沉淀和表面脂肪层，收集上清，分装，-20℃保存。同时利用间接ELISA法测定其效价，以P/N≥2.1 时McAb的最高稀释倍数为此McAb的效价。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞的选育

试验结果显示，细胞融合率达90%左右。采用间接ELISA法检测有细胞克隆生长的培养孔，获得6株阳性杂交瘤细胞，经有限稀释法连续3次亚克隆，杂交瘤细胞培养上清阳性率达100%时，得到了2株杂交瘤细胞。经体外连续培养数代，其分泌抗体的能力不变，分别命名为1H2、1D10。

2.2 鸡血清中IgM的纯化

凝胶层析柱洗脱曲线和SDS-PAGE电泳显示，鸡血清中的IgM和IgG已得到较好分离，提纯的IgM达到了较高的纯度（图1、图2）。

图1 鸡血清中免疫球蛋白的洗脱曲线

图3 间接ELISA检测单抗腹水效价

2.3 杂交瘤细胞分泌McAb稳定性测定2株杂交瘤细胞经连续培养4个月及液氮冻存5个月后复苏培养，用间接ELISA法检测培养上清，OD490nm值没有明显变化，表明这2株杂交瘤细胞株能非常稳定地分泌特异性McAb。

2.4 McAb效价测定

间接ELISA检测方法显示，1H2、1D10腹水抗体效价分别为1：1×106和1：1×107（图3）；亚型鉴定结果表明，McAb 1H2、1D10均为IgG1κ亚型。

3 讨论

IgM重链恒定区在种间是高度保守的，而且在恒定区还具有同种型决定簇。本试验采用原核表达技术，利用大肠杆菌表达系统高效表达鸡IgM μ链蛋白，并以其作为免疫原制备McAb，打破了从血清中纯化IgM制备McAb的常规方法。结果证明该方法同样行之有效。而且本试验制备的抗鸡IgM μ链McAb可以通过Protein G 亲和层析纯化，将提纯后的McAb进行HRP标记［7］，可以为进一步的研究简化步骤。

一般鸡群均接种过菌（疫）苗，而常规血清学诊断检测的抗体都为IgG，因此只有当所测的抗体滴度高于疫苗接种产生的抗体滴度时才能作出诊断。而抗鸡IgM μ链McAb可以作为免疫诊断试剂通过双夹心ELISA检测病原微生物特异性的IgM，为传染性疾病的早期快速诊断提供了新且简便的途径。抗鸡IgM μ链McAb还可以用于检测组织部位中含有IgM的细胞以及对外周血中具有IgM表面抗原受体的细胞进行定量，并且可以通过与B细胞膜表面抗原结合，在体内外从分子水平上研究B细胞抗原提呈特点，从而为显著降低疫苗接种剂量、提高机体免疫能力等方面的探索提供了新的实验手段。

［1］DePinho R，Kruger K，Andrews N，Lutzker S，Baltimore D，Alt FW. Molecular basis of heavy-chain class switching and switch region deletion in an Abelson virus-transformed cell line ［J］.Mol Cell Biol，1984，（4）：2905-2910.

［2］Yancopoulos G D，DePinho R A，Zimmerman K A，Lutzker S G，Rosenberg N，Alt F W. Secondary genomic rearrangement events in pre-B cells：VHDJHreplacement by a LINE-1 sequence and directed class switching ［J］.EMBO J，1986，（5）：3259-3266.

［3］欧阳著锋，蔡美英，章崇杰，等.分泌抗人IgM μ链McAb杂交瘤细胞株的建立［J］.衡阳医学院学报，1997，（9）：230-235.

［4］郑鑫，朱世成，李家奎，等.猪生长激素单克隆抗体的制备及其特性［J］.中国兽医学报，2005，25（3）：293-294.

［5］孙建宏，曹殿军，刘培欣，等.从血清中分离纯化鸡IgG、IgM的实用方法［J］.中国预防兽医学报，2000，22（5）：378-380.

［6］钱建飞，毛洪先，邵国青，等.抗鸡IgM单克隆抗体的研究Ⅰ.亲和层析纯化鸡IgM ［J］.江苏农业学报，1994，10（2）：33-36.

［7］余鹏博，王敬军，张家驹，等. IgM捕捉ELISA检测肾综合征出血热试剂盒研制［J］.中国公共卫生，2006，22（2）：173-175.

赵莉（1982-），女，江苏泰州人，硕士生，兽医师。

鲍恩东