孵化场微生物学检测的方法及其标准的探索

曾 红

（贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阡 550000）

孵化场微生物学检测的方法及其标准的探索

曾 红

（贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阡 550000）

1种蛋表面微生物学检测

1.1 检测材料

被测种蛋与胚蛋，普通琼脂培养基、灭菌的蒸馏水、灭菌的试管、刻度吸管和棉签、铁丝规板（D为3.5cm）。

1.2 检测方法（棉签拭抹法）

（1）将被测的种蛋或胚蛋夹在特制的规板内，种蛋大头朝上。每批种蛋至少检测20枚，分别按部门分栋号采样。

（2）将装有10ml无菌的蒸馏水浸湿无菌的棉签，在试管壁上挤去多余的灭菌蒸馏水，然后在规板范围内滚动棉签涂抹蛋壳表面取样。

（3）折断棉签的手持端，使棉签落入蒸馏水试管中，塞紧试管塞，带回兽医室检测。

（4）若检测种蛋消毒后的效果，可在蒸馏水中加入适量的灭菌中和剂。

（5）反复上下摇动采样的试管，充分洗下棉签上的细菌。

（6）可根据平时检测种蛋表面菌数的多少，将已取样的试管液作递减稀释并记下菌液的稀释倍数。

（7）用灭菌的刻度吸管吸取0.5或1ml细菌悬液，放入装有10～15ml熔化并灭菌冷却到45～50℃的普通琼脂平皿内充分混合。

（8）待琼脂凝固后，置37℃恒温箱中培养24～48h，计数平板上的菌落数。根据平板上的菌落数和菌液的稀释倍数，计算出取样范围内的细菌总数。

1.3 种蛋微生物学检测标准

表1 种蛋表面微生物学检测标准规板（D为3.5cm）

2 孵化器、孵化室、出雏器、出雏场地和运输车空气微生物学检测

2.1 检测用的培养基

5%乳糖琼脂培养基。

2.2 检测方法采用四级分类平板空气暴露法。5%乳糖琼脂培养基数个，开盖后均匀放在检测房的水平地面上；平板在被测房间的地面内空气暴露3min，盖上平板，回收平板；将平板置37℃恒温培养箱中培养24h，计算平板上的菌落数。要求每间房取样2～5个，求其平均菌落数。

2.3 各个空间空气微生物学检测标准

表2 四级分类平板空气暴露法（空气暴露3 min）

3 出雏器微生物学检测

3.1 检测用培养基

胰蛋白酶琼脂培养基；麦康凯琼脂培养基；高盐甘露醇琼脂培养基；沙保葡萄糖琼脂培养基。

3.2 检测方法

采取绒毛检测法。

在出雏过程中，无菌地采集绒毛置于无菌的容器中，带回兽医室检验。用灭菌的滤纸称取0.25g绒毛放入100ml无菌的蒸馏水，充分摇动，使绒毛潮湿不要粘到三角瓶壁上，使混合物静置30min。利用无菌操作技术，分别吸取0.1ml，1.0ml，0.1ml，1.0ml，按表3安排，分别加入到已溶化并冷却到45℃～47℃的4种培养基，充分混合后，倾入灭菌的平皿内。待琼脂凝固后，除沙保葡萄糖琼脂培养基外，均置37℃恒温箱中培养24h，待细菌长出后，计数平板上的菌落数。每台出雏器，至少测定2份绒毛样品，一般抽测2～3台。

3.3 出雏器内绒毛微生物学检测标准

表3 出雏器绒毛微生物学检测标准（菌数/克绒毛）

4 物体表面微生物学检测

4.1 检测材料普通琼脂培养基、灭菌棉签和刻度吸管、带有灭菌蒸馏水的试管；灭菌规板：3.6cm×3.6cm；被检测物品：墙壁、地面、门窗、设备、出雏器、孵化器、蛋托、蛋车、出雏盒、台架、输送带、出雏车。

4.2 检测方法

将规板灭菌后扣在被测物体的表面。在装有10ml无菌蒸馏水的试管中浸湿无菌的棉签，在试管壁上压挤多余的蒸馏水，然后在规板范围内滚动棉签涂抹取样。折去棉签手持端，使棉签落入蒸馏水试管内，塞紧试管塞，带回兽医室检验。若检测刚刚消毒过的物体表面，可在蒸馏水中加入适量无菌的中和剂。反复上下摇动已采样的试管，充分洗下棉签内的细菌。根据平时检测孵化设备表面菌数的多少，可将已取样的试管液做递减稀释，并记下其菌液的稀释倍数。用灭菌的刻度吸管吸取0.5～1ml细菌悬液，放入装有10～15ml熔化并灭菌冷却到45℃～50℃的普通琼脂平皿内充分混合。待琼脂凝固后置37℃恒温箱中培养24～48h，计算平板上的菌落数。根据平板上的菌落数和菌液的稀释倍数计算出取样范围内的细菌总数。

为了有代表性，每个房间采样不能少于5个，然后求出每个规板内细菌总数，最后求出菌落个数/平方厘米。

4.3 孵化厅内物体表面微生物学检测标准

表4 物体表面微生物学检测标准（菌数/cm2）

5 运输车辆表面微生物检测

5.1 检测材料

普通琼脂培养基、灭菌棉签和刻度吸管、带有灭菌蒸馏水的试管；灭菌规板：3.6cm×3.6cm；被检测物品：种蛋车和送雏车的内外壁、地面、棉被。

5.2 检测方法

将规板灭菌后扣在被测物体的表面。在装有10ml无菌蒸馏水的试管中浸湿无菌的棉签，在试管壁上压挤多余的蒸馏水，然后在规板范围内滚动棉签涂抹取样。折去棉签手持端，使棉签落入蒸馏水试管内，塞紧试管塞，带回兽医室检验。若检测刚刚消毒过的物体表面，可在蒸馏水中加入适量无菌的中和剂，反复上下摇动已采样的试管（80次），充分洗下棉签内的细菌。用灭菌的刻度吸管吸取0.5～1ml细菌悬液，放入装有10～15ml熔化并灭菌的45℃～50℃的普通琼脂平皿内充分混合。待琼脂凝固后置37℃恒温箱中培养24～48h，计算平板上的菌落数。

为了有代表性，每个车辆采样不能少于5个，然后求出每个规板内细菌总数，最后求出菌落个数/平方厘米。

5.3 车辆内物体表面微生物学检测标准

表5 车辆表面微生物学检测标准（菌数/ cm2）

6 消毒液微生物学检测

6.1 检测材料

普通琼脂培养基、灭菌刻度吸管、带有灭菌蒸馏水的试管、中和剂（盐酸、吐温80）；被检测物品：消毒池内的消毒液。

6.2 采样地点

门口消毒池、蛋库消毒盆。

6.3 方法

每个检测对象至少取3样品。无菌取使用过的消毒液1ml加到9ml加有灭菌中和剂的蒸馏水中，混匀。用灭菌的刻度吸管吸取1毫升混合液，放入装有10～15ml熔化并灭菌冷却到45℃～50℃的普通琼脂平皿内充分混合。待琼脂凝固后置37℃恒温箱中培养24～48h，计算平板上的菌落数。取其平均菌落数。

6.4 标准

消毒液中菌落总数≤250个/ml，消毒液可以继续使用；消毒液中菌落总数＞250个/ml，消毒液不可使用，必须更换药液。

7 现场消毒试验效果检测

7.1 试验检测材料

（1）采样地点：地面、墙壁，空气，消毒环境温度21℃～25℃。

（2）被测的消毒剂：使用自来水配制所需要的浓度。

（3）消毒工具：喷雾器，采样规板10*10cm2。（4）含有中和剂的灭菌水溶液，灭菌棉签、普通琼脂（融化、灭菌）。

7.2 试验检测方法

消毒前先将消毒的物品和场地彻底清扫、冲洗干净并干燥。用5点采样法，地面5点，空气5点，即中心和4个角落各选1个点；墙壁采用4点法，即四周各采1点；用已灭菌的棉签蘸取含有中和剂的水溶液，在采样规板范围内滚动1次后，剪断棉签的手持端，使其落入含有中和剂水溶液试管中（5ml/管）；空气采用3min暴露法。使用被试验的消毒液，对消毒地点进行喷洒消毒。消毒后1小时，以同样的方法在消毒场所再次取样1次，两次取样点要靠近，但不可重复。将样品带回实验室，利用提拉或吹打的方法，冲洗棉签上的细菌。吸出菌悬液1ml，用灭菌蒸馏水以10倍稀释法将其稀释至10-3。

消毒前后的样品：从每个稀释后的样品中各取3ml，分别放在3个灭菌的平皿内，每个平皿1ml（即每个稀释度使用三个平皿），然后每个平皿内倒入融化灭菌并冷却至45～50℃的营养琼脂15～18ml，充分混匀，待琼脂凝固后，置37℃恒温培养箱中培养18～24小时。观察细菌生长情况，进行菌落计数，根据样品的稀释度换算出每一个测试点的菌落数。

7.3 结果判定标准

该消毒剂在现场消毒1h后灭菌率达到90.0%以上，故消毒剂是一种良好的消毒剂，可以投入生产使用，否则，此种消毒剂灭菌效果不佳，则寻找此种药物在5分钟内杀灭本场内标准菌株灭菌率达到99.9%的最低有效浓度.

8 孵化场的微生物学检测的计划和基本要求

（1）凡是从生产部门运来的入孵前种蛋和孵化器的胚蛋，每枚种蛋规板内的菌数不应超过120个，即达到良级标准，入孵前的种蛋（已熏蒸）不应超过60个/规板。

（2）空气检测，平时检测不应超过20个/平板（暴露3min），即达到良好标准。

（3）所有物体表面的菌数应低于20个菌落/cm2，即达到良级标准。

（4）检测计划：

①每个厅（20台）的孵化室每月至少抽测1次，孵化器抽测2台以上，一般两次/月为宜。

②每一个种鸡生产部门运送来的种蛋，每个月至少抽测两次，每次抽测4个栋号，10枚/栋。

③每个厅的出雏室和出雏场地，每一个月至少检测两次。

④检测入孵前种蛋熏蒸效果和洗盘消毒效果，每个月每个厅抽测2～3次。

⑤运雏车辆每周抽测1次，2辆/次；种蛋车按种鸡生产场检测，2次/月，2辆/次；

⑥消毒药液微生物检测：每周检测一次，药液菌数必须达到250个以下；

⑦消毒药品消毒效果检测：每购入新的批号消毒药品必须测定该种药物30min杀灭本场内标准菌株灭菌率达到99.9%的最低有效浓度，然后用此浓度进行现场消毒试验，消毒1h后灭菌率必须达到90.0%以上。

总之，对孵化场环境、种蛋、运输车辆和消毒药物灭菌效果进行定期检测，可以随时了解孵化场病原微生物的种类和数量，以及每种消毒药物现场消毒效果，可以有目的选择消毒药的种类和最低有效消毒浓度，做到有的放矢，从而减少不必要的消毒药物浪费，降低有害病原微生物对孵化场环境和雏鸡的影响，为全力打造4A雏鸡品质奠定良好的基础。