海南石莼多糖的提取与分离及其结构性质的初步研究

宋伟康，田 华，尹学琼，朱 莉，邱碧宁, 陈俊华

(1.海南大学 海南省精细化工工程技术研究中心，海南 海口 570228)



海南石莼多糖的提取与分离及其结构性质的初步研究

宋伟康，田 华，尹学琼，朱 莉，邱碧宁, 陈俊华

(1.海南大学 海南省精细化工工程技术研究中心，海南 海口 570228)

在碱性条件下，从海南石莼中提取了石莼粗多糖，并对其进行了醇沉纯化，同时，对其多糖总糖、蛋白质、糖醛酸、硫酸基的含量进行了测定，并分析了多糖的结构，结果表明：在碱性条件下更有利于ULP的溶解；当料液比过高时会导致后续处理中多糖的流失，从而降低多糖产率；在碱液条件下，过长处理时间会导致多糖降解；石莼粗多糖的提取温度以70～90 ℃为宜.正交实验表明：石莼粗多糖的最佳提取工艺为：NaOH溶液的质量分数为2%，料液比为1∶80，在90 ℃恒温水浴5 h后再在90 ℃超声1 h，其提取率达17.57%.此外，检测了石莼多糖的理化性质，测定了其分子质量和纯度，并对其进行了红外光谱分析、元素分析以及表面活性测试.

石莼； 多糖提取； 理化性质； 表面活性

海藻是一种结构简单的低等海洋植物，主要有绿藻、红藻、褐藻、蓝藻等种类[1].全世界藻类资源约30 000多种，海藻资源约15 000种，资源丰富[2].海藻中含有多种营养成分，如蛋白质、矿物质、微量元素、海藻多糖等[3]，海藻多糖是海藻具有重要食用和营养价值的主要原因，它具有抗病毒、抗氧化、提高免疫力、抗肿瘤、消脂减肥等功效.海藻多糖在医药、食品、化工和化妆品等领域已广泛应用[4].

石莼【Ulva lactuca L.】归属于绿藻门，丝藻目，石莼科，石莼属，其藻体一般呈绿色，是一种常见的海藻.石莼自古以来就被作为药材，最早记载于《本草拾遗》，曰：“石莼生南海，附石而生，似紫菜，色青”，主“味甘五毒，入水，利小便”[5].石莼与其他药用植物配合可以治疗中暑、疮、高血压、水肿、甲状腺肿大、急性慢性肠胃炎、咽喉炎、小便不利等[6].近年来，随着科技的进步，现代研究表明石莼有着很好的抗病毒、抗氧化、抗癌、抗凝血性能，具有净化血液和降低胆固醇等功效，其中，多糖为主要的活性成分[7-8].南海海域约有356万平方公里，面积宽广，蕴藏丰富的生物资源，其中经济藻类有162种，该海域属于热带海洋环境，特殊的海洋环境使得其海藻种类及成分具有独特性.但是，由于南海海域的温度较高，因而导致该海域的海藻生成速度较快，尤其是每年的春季，南海周边海域常有石莼大面积爆发，这对周围环境产生了不良影响，因此，加强南海石莼的相关基础研究对扩大其资源利用具有重要意义.

根据海藻多糖的结构不同，海藻粗多糖的提取方法主要有水提、酸提和碱提[9-11]，本文采用NaOH水溶液对海南石莼进行超声浸提，以制备石莼多糖，并通过分级醇沉对石莼多糖进行分离和纯化，此外，通过FTIR、GPC对其结构进行了初步分析，测试了石莼多糖的表面张力.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器 石莼来源于海南省海口市白沙门，新鲜的石莼呈绿色带状，晒干后变为墨绿色.将石莼晒干后装入袋内备用.所用试剂：氢氧化钠、双氧水、浓硫酸、苯酚、明胶、氯化钡、氯仿、正丁醇、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、四硼酸钠，均购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯.

所采用的仪器设备有：旋转蒸发仪(上海嘉鹏科技有限公司)；全自动表界面张力测量仪(JK99B，北京商德通科技有限公司)；新锐可见分光光度计(T6，北京普析通用仪器有限责任公司)；傅里叶变换红外光谱仪(TENSOR27，德国Bruker公司)；1515凝胶渗透色谱仪(美国Waters公司)；冷冻干燥机(FD-1E，北京德天佑科技发展有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 多糖提取[9]称取干燥的石莼2 g，分别加入120 mL w=1%的NaOH溶液，在80 ℃恒温水浴4 h，过滤，滤液旋蒸浓缩至30 mL.以V氯仿∶V正丁醇=4∶1的比例，配制30 mL 萃取剂(Sevage溶剂，现配现用).将萃取剂加入到多糖浓缩液中，在分液漏斗中剧烈振荡15 min后放置30 min，去除有机溶剂层和蛋白质层.重复以上操作，直至没有白色的蛋白质层.将多糖溶液放入透析袋中透析2 d，透析液经冷冻干燥后得石莼粗多糖(ULP).

1.2.2 石莼粗多糖醇沉纯化[10]称取2 g石莼粗多糖(ULP)，加入80 mL蒸馏水溶解，用φ=20%的乙醇进行醇沉，在4 ℃静置，离心分离后收集沉淀物.向上清液加入无水乙醇，使乙醇的体积分数依次以10%的增量递增至90%.收集各部分沉淀，干燥，得石莼精多糖；最后，准确称量石莼精多糖质量，计算其收率.

1.2.3 石莼多糖的理化性质分析

1.2.3.1 石莼粗多糖总糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法测多糖含量[11]，用葡萄糖为标准样品，绘制标准曲线，得回归方程：Y=13.937 00X-0.007 10，R2=0.997 10.量取1 mL浓度为0.08 mg·mL-1的 ULP溶液，测试其吸光度，根据上述回归方程计算ULP中的多糖含量.

1.2.3.2 蛋白质含量的测定 采用Bradford法测定粗多糖中蛋白质的含量[12].精确称取0.1 g G-250染料试剂(考马斯亮蓝)，溶解于50 mL φ= 95%的乙醇，再加入100 mL φ= 85%的浓磷酸，用去离子水稀释至1 L.精确称取0.1 g牛血清蛋白质(BSA)，用去离子水溶解至100 mL，配制成1 mg·mL-1的标准溶液.吸取标准溶液0，10，20，40，60，80 μL，分别加去离子水至0.1 mL，再分别加入5 mL G-250试剂，振动混匀，静置5 min后，于595 nm处测吸光度.以BSA质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线.回归方程：Y=0.633 68X+0.015 21，R2=0.995 66.配制样品质量浓度为1 mg·mL-1，取100 μL按照上述步骤操作，并根据标准曲线回归方程计算蛋白质的含量.

1.2.3.3 糖醛酸含量的测定 以葡萄糖醛酸为标准物质，用硫酸-咔唑法检测石莼多糖中的糖醛酸含量[13].准确称取0.1 g咔唑，溶于φ= 95%的乙醇，定容(容量瓶)至100 mL.

精密称取0.954 0 g硼砂(四硼酸钠)，均匀地撒入100 mL浓硫酸中，于超声下使硼砂溶解，静置过夜，获得硼砂-硫酸显色剂溶液.以0.25 mg·mL-1的葡萄糖醛酸为标准溶液，准确吸取标准溶液0，10，20，30，40，50，60 μL于具塞试管中，分别加水补至1 mL，在冰浴中加入6 mL硼砂-硫酸溶液，再加入200 μL咔唑溶液，以漩涡混匀器混匀，于100 ℃中加热10 min，取出后以冰浴冷却至室温，测试530 nm处的吸光度.根据所测结果得线性回归方程Y=7.121 40X+0.033 75，R2=0.996 67.配制样品的质量浓度为2 mg·mL-1，取0.5 mL，按照上述步骤操作，根据标准曲线得回归方程，然后分别计算各个石莼精多糖中的糖醛酸含量.

1.2.3.4 硫酸基含量的测定 采用氯化钡-明胶比浊法测定石莼多糖中的硫酸基含量[14].

但动物园中的北白犀停止了繁殖。研究发现，雄性犀牛为了保护领地而发生争斗是激发性激素的重要途径。但人工环境中，雄性犀牛没有了领地，也无法维持以前的领地意识，性激素分泌锐减；雌性犀牛长期不能繁殖，导致繁殖能力衰退直至绝育。

1.2.4 结构分析 采用KBr压片法对多糖进行傅立叶转换红外光谱测定，波长范围在4 000～400 cm-1.将石莼多糖样品在60 ℃条件下干燥12 h，然后用Vario Micro Cube元素分析仪对其进行元素分析.以高效凝胶渗透色谱鉴定多糖的相对分子质量，精密称取2 mg石莼精多糖，配制成质量浓度为2 mg·mL-1的多糖溶液，以w= 0.05%的氮化钠水溶液为流动相，流速：0.6 mL·min-1；UltrahydrogelTM500和UltrahydrogelTM120双柱串联分离，柱温45 ℃；示差检测器2414，检测器温度40 ℃；Waters 泵1515，进样量：10 μL，手动进样.

1.2.5 表面活性测试 先将全自动表界面张力测量仪开机预热30 min，将铂片用水冲洗2 min，然后在酒精灯上烧红，接着将铂片挂在张力仪吊钩上，稳定2 min.分别配制20 mL 5 mg·mL-1的ULP，ULP70，ULP80多糖溶液，放入样品皿中，按测试键，样品台缓缓上升，接触液面，表面张力仪上出现表面张力值，待读数稳定后，按停止键和向下键，记下读数.每个样品测试均重复3次.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 NaOH质量浓度的影响 在提取温度为80 ℃、料液比为1∶60、提取时间为恒温水浴4 h的条件下，以去离子水和质量分数分别为1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的氢氧化钠溶液提取ULP，所得多糖提取率与NaOH质量浓度的关系如图1所示.从图1可以看出，不含NaOH的纯水的ULP提取率最低，仅6.75%；随着NaOH质量浓度升高，提取率增加，w=2 %的氢氧化钠溶液的提取率最高，达11.80%，这说明碱性条件下可能更有利于ULP的溶解；当质量浓度从2%增加到3%时，产率反而下降，这可能是因为碱质量浓度升高而导致多糖降解之缘故[15].

2.1.2 料液比的影响 在提取温度80 ℃、恒温水浴4 h、NaOH溶液质量分数为1.0%的条件下，考察料液比为1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90时对提取率的影响，结果如图2所示.从图2中可以看出，料液比为1∶50时，提取ULP的产率最低，为7.07%；料液比为1∶80时，提取ULP的产率最高，为11.95%.这可能是因为石莼叶片经热水煮后发胀，需要更多的溶液来浸泡，才能提高多糖的提取产率.当料液比过高时，会导致后续处理中的多糖流失，从而降低多糖产率.

2.1.3 提取时间的影响 在温度为80 ℃、NaOH溶液质量分数为1.0%、料液比为1∶60的条件下，提取时间分别为4 h，5 h，6 h，7 h时，提取率结果如图3所示.从图3中可以看出，当提取时间为4 h，5 h，6 h，7 h时，所对应的多糖产率分别为9.03%，10.21%，11.13%，9.54%；提取时间为6 h时，ULP的提取率最高；此后随提取时间延长，提取率下降，这是由于在碱液条件下，过长处理时间会导致多糖降解的缘故.

在上述水热浸提法的基础上，再将容器放在1 h超声波清洗器中进行超声辅助提取法，结果表明，在料液比为1∶60，提取温度为80 ℃，碱质量分数为1.0%的条件下，水热浸提法的产率为9.04%，超声辅助提取法产率为11.16%.超声辅助提取法的提取产率比水热浸提法的提取产率高2.12%，因此，后续正交实验中采用超声波辅助提取法.

2.2 正交实验结果 根据上述实验结果，本文设计了L9(34)正交实验(因素水平表如表1)，正交实验结果如表2所示.

表1 正交实验因素水平表

注：“4+1”表示先在水浴中提取4 h，再在超声波中提取1 h，其余类同.

表2 正交实验结果

由表2可知，各因素作用的主次顺序依次为：提取温度 >提取时间> 碱质量分数 > 液料比，NaOH的质量分数和提取温度对ULP的提取影响较大.由正交实验得出，ULP的最佳提取工艺应为：NaOH溶液的质量分数为2%，液料比1∶80，在90 ℃恒温水浴5 h后，再在90 ℃超声1 h，ULP的提取率达17.57%.

2.3 石莼多糖的分级纯化 本文采用不同体积分数的乙醇进行分步醇沉，分别以φ=70%和φ=80%的乙醇进行沉淀，得ULP各组分，即ULP70和ULP80，其收率分别为33.44%，15.05%，其余乙醇体积分数下所得的多糖极少.因此，后续工作主要是对产率较高的ULP70和ULP80进行研究.

2.4 石莼多糖的理化性质 根据1.2.3中的检测方法，得出石莼多糖的理化性质如表3：

表3 石莼多糖的理化性质

ULP70与ULP80糖醛酸的含量基本相同，而硫酸基含量的结果显示，ULP80的硫酸基含量明显要高于ULP70，这是因为多糖的相对分子质量不同，其结构存在差异性，多糖的硫酸基含量以及单糖组分也会存在不同.

2.5 分子质量以及纯度测定 采用GPC检测ULP70和ULP80的分子质量以及纯度，结果如表4所示，ULP70的平均分子质量约为188 949.726 u,ULP80的平均分子质量约为229 938.82 u.这与文献中所报道的海藻硫酸多糖具有较高的分子质量，其分子质量大于999 734 u相符[16].再从分散系数PI来看，ULP70的分散系数为1.31，ULP80的分散系数为1.69，两者的分散系数均小于2，这充分说明ULP70和ULP80的分子质量分布较均匀，纯度较高[17].

表4 石莼精多糖GPC的测试结果

2.6 红外光谱分析 图5为石莼多糖的红外光谱图，酸化ULP为ULP70用稀盐酸酸化后的样品.由图5可见， ULP70，ULP80的红外光谱图十分相似，所表现出的吸收峰均符合糖类化合物的特征[18-19]：3 449 cm-1处出现的强吸收峰为糖分子中的O—H伸缩振动.2 930 cm-1位置上的吸收峰是糖分子的C—H伸缩振动峰.1 417 cm-1处的吸收峰为糖分子中C—H的变角振动峰.1 635 cm-1左右处的吸收峰为CO的伸缩振动峰.在图5c中，样品酸化后，在1 731 cm-1附近出现新的吸收峰，说明该糖含有羧基.1 260 cm-1处为—O—SO3H中SO的伸缩振动峰.1 032 cm-1处为C—O—C环的C—O伸缩振动峰，这说明该类糖主要为吡喃多糖，在849 cm-1左右的吸收峰被可认为是C—O—S的伸缩振动(轴向配位)，并得出硫酸基的连接方位属于垂直位置，再结合后面的单糖分析，说明石莼多糖中单糖组分含有C—2或C—3连接硫酸基团的鼠李糖[20]，这与表面张力的结果一致，这也进一步说明鼠李糖的存在.

2.7 元素分析 对ULP70和ULP80进行元素分析，结果如表5.从表5中可以看出，ULP70和ULP80的C，H，O的原子个数比基本上符合糖类化合物的通式Cn(H2O)n，再结合红外光谱分析，由此可以确定，石莼精多糖ULP70和ULP80属于糖类化合物.表5显示了ULPs所含的S元素含量与硫酸基含量，其测定结果显示，石莼精多糖的硫酸基含量均较高，两种测试方法的结果相一致.

表5 石莼精多糖的元素分析结果

2.8 表面活性测试 在常温下，ULP，ULP70，ULP80的质量浓度为5 mg·mL-1时，平行测试3次表面张力，取其平均值，结果如表6：

表6 石莼多糖的表面张力

从表6可以看出，石莼各组分多糖水溶液的表面张力较小.这说明石莼多糖在结构上有疏水基团甲基等取代基，比如鼠李糖，岩藻糖等；再结合前面的红外分析，可以初步确定存在鼠李糖.这进一步说明石莼多糖可以用作新型天然的表面活性剂.

3 结 论

在最佳提取工艺条件下，从海南石莼多糖提取石莼粗多糖ULP的产率为17.57%，总糖含量为47.50%；乙醇分步醇沉可得到2种纯度较高的多糖组分.通过理化性质分析、元素分析和红外分析得出，石莼多糖为含有硫酸基团的酸性吡喃糖.通过吊片法所测得的石莼多糖水溶液的表面张力较小，与红外分析结合，初步可确定在石莼多糖的结构上有疏水基团甲基等取代基.石莼多糖的表面性能可使其成为食品、化妆品和药用成分的潜在天然原料.后续对其结构和活性还需要做进一步的深入研究，以便为今后将其作为一种新型的天然原料或相关产品来开发提供更可靠的理论依据.

[1] Schaeffer D J, Krylov V S. Anti-HIV activity of extracts and compounds from algae and cyanobacteria[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2000, 45: 208-227.

[2] 吕惠敏，张侃. 海藻的利用与开发[J]. 食品科技, 1998(6): 29-30.

[3] Rebello S, Asok A K, Mundayoor S, et al. Surfactants: toxicity, remediation and green surfactants[J]. Environmental Chemistry Letter, 2014, 12: 275-287.

[4] 赵雪, 董诗竹, 孙丽萍, 等. 海带多糖清除氧自由基的活性及机理[J]. 水产学报, 2011, 35(4): 531-537.

[5] 徐娟华，马武翔，谢强敏，等. 石莼多糖的提取分离及其降血脂作用的初步研究[J]. 中国中医药科技, 2002, 9(3): 167-168.

[6] Alves A, Sousa R, Reis R. A practical perspective on ulvan extracted from green algae[J]. Journal of Applied Phycology, 2013, 25: 407-424.

[7] Shao P, Chen M, Pei Y, et al. In intro antioxidant activities of different sulfated polysaccharides from chlorophytan seaweeds Ulva fasciata[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 59: 295-300.

[8] Qi H, Huang L, Liu X, et al. Antihyperlipidemic activity of high sulfate content derivative of polysaccharide extracted from Ulva pertusa(Chlorophyta) [J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(2): 1 637-1 640

[9] 田华，尹学琼，陈娟，等. 绳江蓠多糖的提取及抗氧化活性研究[J]. 化学研究与应用，2014, 26(4): 546-551.

[10] Huang X, Wang D, Hu Y, et al. Effect of sulfated astragalus polysaccharide on cellular infectivity of infectious bursal disease virus[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2008, 42: 166-171.

[11] 孟庆勇，王亚飞，揭新明，等. 粗江蓠多糖的提取及光谱分析[J]. 光谱学与光谱分析, 2006, 26(10): 1 903-1 906.

[12] 王孝平, 邢树礼. 考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J]. 天津化工, 2009,23(3): 40-41.

[13] Bitter T, Muir H M. A modified uronic acid carbazole reaction[J]. Analytical Biochemistry，1962,4(4): 330-334.

[14] Souza B W S, Cerqueira M A, Bouebon A I, et al. Chemical characterization and antioxidant activity of sulfated polysaccharide from the red seaweed Gracilaria birdiae[J]. Food Hydrocolloids, 2012, 27(2): 287-292.

[15] 田华, 刘芳, 尹学琼，等. 浒苔多糖的提取及结构活性对比研究[J]. 食品科技, 2013, 38(10): 205-209.

[16] Lahaye M. Developments on gelling algal galactans, their structure and physico-chemistry[J]. Journal of Applied Phycology, 2001, 13(2): 173-184.

[17] 郑必胜, 金江涛, 闫文娟. 广东虫草多糖的醇沉及凝胶渗透色谱法表征其分子量分布的研究[J]. 食品工业科技, 2009, 30(5): 120-123.

[18] QI H M, Huang L Y, Liu X L, et al. Antihyperlipidemic activity of high sulfate content derivative of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta)[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(2): 1 637-1 640.

[19] Shao P, Chen M, Pei Y, et al. In intro antioxidant activities of different sulfated polysaccharides from chlorophytan seaweeds Ulva fasciata[J]. International Journal of Biological Macromolecules. 2013, 59: 295-300.

[20] 张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M].杭州:浙江大学出版社, 1999：193-253.

Extraction, Primary Structure and Properties Investigation of Polysaccharides fromUlvalactucaL.

Song Weikang, Tian Hua, Yin Xueqiong, Zhu Li, Qiu Bining, Chen Junhua

(Hainan Provincial Fine Chemical Engineering Research Center, Hainan University, Haikou 570228, China)

In NaOH solution, polysaccharides (ULP) were extracted from Ulva lactuca L., and the alcohol precipitation and purification were performed. The contents of polysaccharides, protein, uronic acid, and sulfate group were determined and the structure of polysaccharides were analyzed. The extraction conditions were optimized through single factor experiments and orthogonal experiments. The results indicated that it was under the conditions of 2% NaOH, 90 ℃, material/water ratio 1:80, liquid extraction 5 h and subsequent ultrasound-assisted extraction 1h that the highest yield of 17.57% was obtained. The physic-chemical characters of ULP were analyzed, the molecular weight and purity were determined. The infrared spectrum analysis, element analysis and surface activity test were also performed.

Ulva lactuca L.; extraction; physico-chemical properties; surface activity

2016-01-28

国家自然科学基金(21264007，21466011)；海口市重点科技计划项目(2010-0084)

宋伟康(1993-)，男，安徽铜陵人，海南大学材料与化工学院2015级硕士研究生，E-mail：2402694943@qq.com

尹学琼(1975-)，女，四川射洪人，教授，博士生导师，研究方向：生物资源的开发与利用，E-mail：yxq@hainu.edu.cn

1004-1729(2016)03-0243-07

Q 539

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0037