马关无角山羊卵巢颗粒细胞INHA基因siRNA的筛选与鉴定

富国文，王绍卿，祁会彩，滕晓红，达永仙，樊月圆

（1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；2.西安市未央区动物卫生监督所，西安 710016）

繁殖与生理

马关无角山羊卵巢颗粒细胞INHA基因siRNA的筛选与鉴定

富国文1，王绍卿1，祁会彩2，滕晓红1，达永仙1，樊月圆1

（1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；2.西安市未央区动物卫生监督所，西安 710016）

为了研究INHA基因在马关无角山羊卵泡发育中的作用，设计并化学合成了3条针对INHA基因的siRNA，脂质体法转染至马关无角山羊的卵巢颗粒细胞，Real-time PCR技术和Western-Blot技术对其干扰效率进行了筛选。结果表明：siRNA-2对INHA基因mRNA表达抑制率达到了94.3%，对蛋白表达的抑制率达到了93.4%，是INHA基因沉默的最佳干扰质粒，可为今后研究INHA基因的功能提供基础。

马关无角山羊；INHA基因；siRNA

马关无角山羊是云南省优良的地方畜禽品种之一，公母羊均无角，故性情温顺，易于管理，其头部有鬃，当地俗称“马羊”。主要产于云南省马关县，生活于海拔700～1 700 m的山区。该品种具有繁殖力高（200%～400%）、性成熟早（母羊3月龄即可发情配种，公羊6月龄即可配种）、生长快、性情温顺、肉膻味小、耐粗饲和抗病力强的特点。特别是在无角、多胎性和肉质方面，堪称山羊珍稀品种资源［1-2］。

抑制素（inhibin，INH）是由睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞分泌的糖蛋白激素，属于转化生长因子超家族成员，该家族主要调控细胞的生长与分化。INH是由α、β两个亚基组成的异二聚体，β亚基又分为A、B两种，故INH存在两种形式，即INHA（αβA）和INHB（αβB）［3-5］。研究发现，INH对猪、牛、羊、鸡等动物的卵泡生长发育有着重要的作用［6-9］。INHA对雌性动物卵泡发育的作用随着卵泡的逐渐成熟而增强，这种作用具有剂量依赖性，因此INHA被认为是确定单胎和多胎动物种属特异性排卵数最重要的激素之一［10-12］。其主要功能是通过反馈调节FSH的分泌参与卵泡发育调节。同时，在卵泡颗粒细胞上存在INH的特异结合位点。Geng等［13］和滑国华［14］通过超表达和RNAi技术，研究了INHA基因对牛卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响，结果证明，INHA能抑制卵巢颗粒细胞的增殖，促进卵巢颗粒细胞的凋亡。

RNAi技术为研究者提供了很好的技术平台，能高效特异性地阻断基因的表达，进而实现细胞水平的基因敲除。本研究对构建的3个干扰质粒的干扰效率进行筛选，为进一步研究INHA基因的功能提供了基础材料。

1　材料与方法

1.1试剂与主要仪器

主要试剂：DMEM/F12（Hyclone），胎牛血清（Gibco），PureYield质粒中量纯化系统（去内毒素）（Promega），Lipofectamine 2000 Reagent（Invitrogen），TRIzol（北京天根），ReverTraAce-α-逆转录试剂盒（TOYOBO），AceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix（Toyobo），Rabbit Anti-INHAPolyclonal Antibody（NOVUSbiologicals），PVDF膜（Millipore）。

主要仪器：CO2培养箱（ThermoFisher Forma），倒置荧光显微镜（Nikon），CFX PCR仪（Bio-Rad），转膜槽（Bio Rad）。

1.2方法

1.2.1马关无角山羊卵巢颗粒细胞的培养实验母羊肌肉注射氯前列腺醇钠，每只0.1 mg，40 h后麻醉，通过手术打开腹腔，用无菌注射器抽取卵巢表面颜色透明、微透亮，血管丰富的卵泡，获得带有颗粒细胞的卵泡液，将卵泡液用不含Ca2+和Mg2+的PBS液洗3次，0.2%透明质酸酶消化3 min，再用DMEM/F12细胞培养液洗2遍，每次1 500 r/min离心10 min，回收细胞，制得颗粒细胞悬液，按3×105/孔接种于24孔细胞培养板。

1.2.2转染将纯化后的卵巢颗粒细胞用0.25%的胰酶消化，转于25 cm2的培养瓶中，待细胞长满瓶底的60%～80%时，用Lipofectamine 2000转染INHA基因干扰片段，转染步骤如下：①用250 μL无血清的DMEM/F12培养基稀释10 μL的干扰片段（20 μM），同时用250 μL无血清培养基稀释8 μL的Lipofectamine 2000，轻轻混匀后，分别静置5 min；②将干扰片段和脂质体的稀释液混合，轻轻混匀后，静置20 min；③将混合液加入含卵巢颗粒细胞的培养瓶中，补加1.5 mL的无血清培养基，使终体积为2 mL；④放入CO2培养箱中，6 h后换成含10%血清的培养基培养。培养48 h后收集细胞进行鉴定。

表1　INHA基因的siRNA序列信息

1.2.3Real-time PCR检测干扰质粒的干扰效率将细胞收集于RNase-Free离心管中，采用传统的Trizol法提取总mRNA，反转录获得cDNA。根据Genbank中山羊的INHA的mRNA全序列，取其保守区，设计RT-PCR引物，引物序列为：F：5'-CCGGCCATCCCAGCACACAC-3'，R：5'-GGCGGAGCAGGAACAGAG AGG-3'，内参基因GAPDH的引物序列为：F：5'-CGGCTACAGCAACAGGGTGG-3'，R：5'-GGTGGAGGTGGGGCAGGAC-3'。基因表达量计算公式为：PCR反应后，根据软件分析数据，应用2-△△CT方法对基因的表达水平进行相对定量。

1.2.4Western blot检测干扰质粒的干扰效率细胞收集于1.5 mL离心管中，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解，对裂解液反复吹打，离心获得总蛋白，BCA法测蛋白浓度。目的蛋白分子量大小为40 KD，配置5%的浓缩胶和8%的分离胶，煮样后电泳、转膜、封闭，一抗孵育稀释，4℃摇床过夜。置室温30 min后，洗膜3次，每次10 min，加入过氧化物酶标记的二抗，置摇床摇2 h后，化学发光法采集照片。应用Metamorph图像分析软件分析INHA与β-actin的蛋白灰度值，得到各组蛋白相对含量。

1.3统计学处理

试验数据采用SPSS21.0软件进行统计分析，数据用平均数±标准差（SD）来表示，采用One-way ANOVA进行方差分析，采用EXCEL绘制比较图谱。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1马关无角山羊卵巢颗粒细胞的培养

刚分离出来的卵巢颗粒细胞呈圆形或椭圆形，悬浮在含10%胎牛血清的DMEMF12的培养液中，如图1（A）所示。经原代培养后进行了传代，传代24 h后，细胞贴壁，呈梭型或不规则三角形图1（B），72 h铺满了瓶壁的90%（图1（D））。细胞状态良好，可用于下一步实验。

图1　卵巢颗粒细胞的培养结果

2.2卵巢颗粒细胞转染结果

如图2所示，倒置荧光显微镜下可见发绿色荧光的卵巢颗粒细胞。

图2　转染后的卵巢颗粒细胞

2.3Real-time PCR法检测干扰后INHA基因的mRNA表达量

卵巢颗粒细胞中的INHA基因经3个干扰质粒干扰后的mRNA的表达量如图3所示。干扰后siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3组的INHA基因的mRNA的表达量与正常组和NC组比较明显降低（P＜0.01），其中siRNA-2组的表达量最低。

图3　转染后INHA基因的mRNA相对表达量

2.4Westernblot法检测干扰后INHA蛋白的表达量

转染48 h后抽提蛋白，经Western blot检测发现，正常组与阴性对照组的Western blot图谱灰度基本一致，而3个干扰组的Western blot图谱灰度都明显降低，其中SiRNA-2的蛋白图谱灰度最低（图4）。应用Metamorph图像分析软件分析INHA与β-actin蛋白灰度值，得到各组蛋白相对含量。如图5所示，siRNA-1、siRNA-2和 siRNA-3组的INHA蛋白的表达量与正常组和NC组比较明显降低（P＜0.01），其中siRNA-2组的蛋白表达量极显著低于其他两组（P＜0.01）。

图4　转染后的Western blot检测结果

图5　转染后INHA蛋白的相对表达量

3　讨论

繁殖性状是家畜的重要经济性状，也是畜牧业生产的主要经济性状之一，尤其对于繁殖力低、繁殖周期和世代间隔长的牛、羊等草食家畜而言，繁殖成本就占据总生产成本的60%～70%。因此，提高牛、羊等草食家畜繁殖力，对降低繁殖成本，提高养殖业经济效益，促进我国畜牧业的快速发展具有重要的意义。动物的繁殖性状主要包括排卵数、产仔/羔数、精液品质等因素，这些因素主要受自体激素水平、相关细胞因子以及相关基因的共同调控。大量研究表明，下丘脑-垂体-卵巢轴（hypothalamus-pituitary-ovarial axis，HPO）对卵泡发育、配子发生及胚胎发育等具有重要的调节作用。抑制素是HPO轴调控系统的重要调节激素，通过调节卵巢颗粒细胞的凋亡/增殖对卵泡的正常生长、分化及闭锁起到刺激或抑制作用［15］。

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术的主要目的是高效特异性降解目标信使RNA（mRNA），阻断翻译蛋白质的过程，从而抑制目标基因的表达［16］。本研究对设计的3条抑制INHA基因表达的siRNA干扰质粒进行了实验验证，结果显示，干扰后INHA基因的mRNA表达水平变化为，siRNA-1干扰质粒使INHA基因的mRNA表达量下降了84%，siRNA-2干扰后，INHA基因的mRNA表达量仅5.7%，siRNA-3干扰质粒的干扰效率为68%；干扰后INHA蛋白的表达水平分别为，siRNA-1干扰质粒使INHA蛋白的表达量下降了61%，siRNA-2干扰后，INHA蛋白表达量仅6.6%，siRNA-3与siRNA-1的干扰效果差别不大，蛋白表达量43%。由此可见，不论是mRNA水平还是蛋白水平，siRNA-2质粒对INHA基因的干扰效率都达到了最佳。为下一步体内、外研究INHA基因的功能奠定了实验基础。

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Selection and Identification of siRNA against INHA Gene in Ovarian Granular Cells of Maguan Polled Goats

Fu Guowen，WangShaoqing，Fan Yueyuan，et al
（College Animal Science&Technology，Yunnan Agriculture University，Kunming650201，China）

In order tostudythe role ofINHA gene in the follicular development ofMaguan polled goat，three siRNAagainst INHA gene were designed and synthesized，then these siRNA were transfected into the ovarian granular cells of goats via lipofectamine，and the interference efficiency were screened by Real-time PCR and Western-Blot.The results showed that the inhibition rate of siRNA-2 for INHA gene mRNA expression was 94.3%，and that for protein expression was 93.4%.So siRNA-2 is the best interference plasmid ofINHA gene silencing，and which can provide the basis for the studyofINHA gene function in the future.

Maguan polled goats；INHA gene；SiRNA

S827.3

A

2095-3887（2016）01-0015-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.005

2015-11-25

云南省科技计划面上项目（2012FB147）

富国文与王绍卿同为第一作者。富国文（1980-），男，在读博士；王绍卿（1972-），男，硕士，副教授。

樊月圆（1979-），女，讲师，博士，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。