宫颈鳞状细胞癌中DNA损伤修复基因NBS1的表达与增殖、凋亡的相关性分析

谢元媚 张秋实 陈 钰

广东省第二人民医院妇科，广州510317

宫颈鳞状细胞癌中DNA损伤修复基因NBS1的表达与增殖、凋亡的相关性分析

谢元媚 张秋实▲陈 钰

广东省第二人民医院妇科，广州510317

目的研究宫颈鳞状细胞癌中DNA损伤修复基因NBS1表达与增殖、凋亡的相关性。方法选择2012年5月～2015年12月在广东省第二人民医院妇科接受活检的宫颈鳞状细胞癌患者78例作为病理组，宫颈良性病变患者60例作为对照组。收集两组患者的宫颈组织后提取RNA并反转录为cDNA，采用荧光定量PCR法检测NBS1以及Ki67、Cyc1inD1、p27kip1、p57kip2、Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA相对含量。分析各增殖、凋亡相关基因与NBS1 mRNA含量的相关性。结果病理组宫颈组织中NBS1 mRNA相对含量显著高于对照组［（252.5±33.6）比（100.0±14.1），t=14.292、P＜0.05］；病理组宫颈组织中Ki67［（246.4±39.5）比（100.0±12.8）、Cyc1inD1［（203.4±31.8）比（100.0±15.1）］的mRNA相对含量显著高于对照组且与NBS1 mRNA相对含量呈正相关（r=0.761、0.683，均P＜0.05）；p27kip1［（46.5±7.9）比（100.0±13.8）］、p57kip2［（41.3±5.8）比（100.0±14.2）］、Fas［（35.9±6.8）比（100.0±12.7）］、FasL［（44.1±5.5）比（100.0±14.1）］、ActD［（26.8±3.6）比（100.0±16.7）］、Caspase-3［（38.1± 5.8）比（100.0±15.5）］、Caspase-8［（24.2±4.5）比（100.0±11.9）］、Caspase-9［（56.1±7.9）比（100.0±14.6）］的mRNA相对含量显著低于对照组且与NBS1 mRNA的相对含量呈负相关（r=-0.614、-0.705、-0.662、-0.592、-0.783，均P＜0.05）。结论宫颈鳞状细胞癌中DNA损伤修复基因NBS1的表达量异常升高且与增殖、凋亡相关基因的改变有关。

宫颈鳞状细胞癌；NBS1；增殖；凋亡

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，在女性患者中的发病率仅次于乳腺癌，细胞增殖过度以及凋亡不足是疾病发生的关键环节。DNA损伤修复基因NBS1定位于染色体8q21、全长50 kb，所编码的蛋白含有754个氨基酸序列并能够与MRE11及Rad50形成复合体，参与DNA复制和修复、细胞周期调控、端粒稳定性调控等过程［1-2］。近些年，越来越多的研究认识到NBS1基因突变、多态性改变以及表达改变与结直肠癌、肾癌等多种恶性肿瘤的发生有关［3-5］。由此可以推测，NBS1表达的变化可能与宫颈鳞状细胞癌的发生有关，但目前相关的研究仍极为少见。本研究分析了宫颈鳞状细胞癌中DNA损伤修复基因NBS1表达与增殖、凋亡的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2012年5月～2015年12月在广东省第二人民医院（以下简称“我院”）接受宫颈组织病理学活检且确诊为宫颈鳞状细胞癌的78例患者作为病理组，年龄（51.5±6.8）岁、体重指数（22.5±4.1）kg/m2，所有患者均为首次确诊，既往未接受过放化疗，排除远处转移及合并严重肝肾功能不全的患者。选择同期在我院接受宫颈组织病理学活检且确诊为宫颈良性病变的60例患者作为对照组，年龄（52.2±7.1）岁、体重指数（23.1±4.5）kg/m2。两组患者年龄、体重指数比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本采集病理组和对照组患者均在宫颈组织病理学活检时取适量宫颈组织，用生理盐水清洗2～3遍，吸尽水分后放置在冻存管中，在液氮中迅速冷冻30 min，取出后保存在-70℃超低温冰箱中。

1.2.2 基因表达检测取宫颈组织，采用购自天根生化科技（北京）有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒（DP431）分离得到组织样本中的RNA，而后采用TIANScriptⅡRT试剂盒（KR107）将RNA反转录为cDNA，最后将cDNA样本以1∶5的比例稀释并采用Rea1Master Mix（SYBR Green）（FP202）进行PCR反应，反应体系如下：稀释后的cDNA样本2 μL、Rea1 Master Mix 10 μL、10 μmo1/L的上下游引物各0.8 μL、去离子水6.4 μL。反应条件如下：95℃预变性3 min，而后95℃15 s，引物特异性退火温度20 s，72℃20 s并重复40个循环。所扩增的基因包括Ki67、Cyc1inD1、p27kip1、p57kip2、Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9。根据软件读取各个样本扩增后的Ct值，以GAPDH为内参照并按照2-△△Ct计算各个基因的mRNA含量，以对照组样本mRNA含量的平均值为100，计算各个样本mRNA含量的相对值。

1.3 统计学方法

SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈组织中NBS1 mRNA相对含量

病理组宫颈组织中NBS1 mRNA相对含量为（252.5±33.6），对照组宫颈组织中NBS1 mRNA的相对含量为（100.0±14.1）。病理组宫颈组织中NBS1 mRNA的相对含量显著高于对照组，差异有统计学意义（t= 14.292、P＜0.05）。

2.2 增殖相关基因的mRNA相对含量

病理组宫颈组织中Ki67、Cyc1inD1的mRNA相对含量显著高于对照组，p27kip1、p57kip2的mRNA相对含量显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组宫颈组织中增殖相关基因的mRNA相对含量比较（）

表1 两组宫颈组织中增殖相关基因的mRNA相对含量比较（）

组别例数Ki67Cyc1inD1p27kip1p57kip2病理组对照组t值P值78 60 246.4±39.5 100.0±12.8 15.822＜0.05 203.4±31.8 100.0±15.1 11.049＜0.05 46.5±7.9 100.0±13.8 12.585＜0.05 41.3±5.8 100.0±14.2 13.357＜0.05

2.3 凋亡相关基因的mRNA相对含量

病理组宫颈组织中Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA含量显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组宫颈组织中凋亡相关基因的mRNA相对含量比较（）

表2 两组宫颈组织中凋亡相关基因的mRNA相对含量比较（）

组别例数FasFasLActDCaspase-3Caspase-8Caspase-9病理组对照组t值P值78 60 35.9±6.8 100.0±12.7 18.393＜0.05 44.1±5.5 100.0±14.1 15.866＜0.05 26.8±3.6 100.0±16.7 22.586＜0.05 38.1±5.8 100.0±15.5 16.186＜0.05 24.2±4.5 100.0±11.9 25.686＜0.05 56.1±7.9 100.0±14.6 9.485＜0.05

2.4病理组宫颈组织中NBS1与增殖、凋亡相关基因的相关性

病理组宫颈组织中Ki67、Cyc1inD1的mRNA含量与NBS1 mRNA的含量呈正相关（P＜0.05），p27kip1、p57kip2、Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA含量与NBS1 mRNA的含量呈负相关（P＜0.05）。见表3。

表3 病理组宫颈组织中增殖、凋亡相关基因与NBS1 mRNA含量的相关性

3 讨论

NBS1基因表达异常与恶性肿瘤的关系受到了越来越多的关注。NBS1基因所编码的蛋白参与NBS1-MRE11-Rad50复合体的组成。该复合体的功能是调节细胞周期以及端粒稳定性、修复损伤DNA双链、避免DNA复制过程中损伤双链的积累，进而促进细胞周期的进程以及细胞的增殖［6-7］。近年来，越来越多国外学者认识到NBS1表达改变与结肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤的相关性［8-10］，目前国内关于NBS1与恶性肿瘤关系的研究仍较少。欧剑波等［11］的研究显示，口腔鳞状细胞癌中NBS1的表达量显著升高且与恶性生物学行为密切相关。这就提示NBS1可能参与口腔鳞状细胞癌的发生和发展。但是，关于NBS1与宫颈癌发生的关系尚未见报道。本研究对宫颈鳞状细胞癌组织和宫颈良性病变组织中NBS1表达量的分析结果显示：病理组宫颈组织中NBS1 mRNA的相对含量显著高于对照组，提示NBS1的高表达与宫颈鳞状细胞癌的发生有关。

细胞增殖以及凋亡异常是造成恶性肿瘤重要的生物学行为，细胞的增殖和凋亡行为受到多种基因的调控。Ki67是与细胞周期进程密切相关的增殖细胞核抗原，与细胞的增殖活性直接相关［12］。细胞周期蛋白（Cyc1in）能够与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（CDKI）共同参与细胞周期以及细胞增殖的精密调控［13-14］。Cyc1inD1是促进宫颈癌细胞周期进展以及细胞增殖的关键分子，p27kip1、p57kip2能够抑制Cyc1inD1与CDK形成复合物并阻碍细胞周期的进程、抑制细胞增殖［15-16］。本研究对宫颈鳞状细胞癌组织和正常宫颈组织中细胞增殖相关基因mRNA含量的分析结果显示：病理组宫颈组织中Ki67、Cyc1inD1的mRNA含量显著高于对照组且与NBS1 mRNA的含量呈正相关，p27kip1、p57kip2的mRNA含量显著低于对照组，且与NBS1 mRNA的含量呈负相关，提示宫颈癌组织中NBS1的高表达与增殖相关基因的表达改变有关。

在宫颈鳞状细胞癌的发生和发展过程中，不仅存在细胞过度增殖，同时还存在凋亡异常并造成过度增殖的细胞无法被凋亡机制所清除。线粒体通路和死亡受体通路是调节细胞凋亡的两条主要通路，Fas受体被认为能够同时通过上述两条通路参与细胞的凋亡过程［17-18］。Fas与其配体结合后能够通过死亡受体途径激活Caspase-8，进而活化下游的凋亡执行分子Caspase-3［19-20］；而Fas与ActD结合后能够影响Bc1-2/ Bax的表达，并通过线粒体途径激活Caspase-9，进而活化下游的凋亡执行分子Caspase-3［21-22］。本研究对宫颈鳞状细胞癌组织和宫颈良性病变组织中细胞凋亡相关基因mRNA含量的分析结果显示：病理组宫颈组织中Fas、FasL、ActD、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA含量显著低于对照组，且与NBS1 mRNA的含量呈负相关。提示宫颈癌组织中NBS1的高表达与凋亡相关基因的表达改变有关。

综上所述，宫颈鳞状细胞癌中DNA损伤修复基因NBS1的表达量异常升高且与增殖、凋亡相关基因的改变有关。

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Correlation analysis of DNA damage rePair gene NBS1 exPression and Proliferation，aPoPtosis in cervical squamous cell carcinoma

XIE YuanmeiZHANG Qiushi▲CHEN Yu
Department of Gyneco1ogy，the Guangdong No.2 Provincia1 Peop1e's Hospita1，Guangdong Province，Guangzhou 510317，China

Objective To study the corre1ation between DNA damage repair gene NBS1 expression and pro1iferation，apoptosis in cervica1 squamous ce11 carcinoma.Methods Seventy-eight patients with cervica1 squamous ce11 carcinoma received biopsy in Department of Gyneco1ogy，the No.2 Guangdong Provincia1 Peop1e's Hospita1 from May 2012 to December 2015 were enro11ed in patho1ogica1 group，60 cases of cervica1 benign 1esion patients were enro11ed in contro1 group.Cervica1 tissues of patients in two groups were co11ected and RNA was extracted and reverse transcribed into cDNA，then f1uorescence quantitative PCR method was used to measure the contents of NBS1 mRNA and Ki67，Cyc1inD1，p27kip1，p57kip2，Fas，FasL，ActD，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9；the re1ationships between those pro1iferation，apoptosis re1ated genes and content of NBS1 mRNA were ana1yzed.Results Re1ative mRNA contents of NBS1 in the cervica1 tissues of the patho1ogica1 group were significant1y higher than those in the contro1 group［（252.5± 33.6）vs（100.0±14.1），t=14.292，P＜0.05］；re1ative mRNA contents of Ki67［（246.4±39.5）vs（100.0±12.8）］，Cyc1inD1［（203.4±31.8）vs（100.0±15.1）］in cervica1 tissues of the patho1ogica1 group were significant1y higher than those in the contro1 group and positive1y corre1ated with re1ative contents of NBS1 mRNA（r=0.761，0.683，a11 P＜0.05）；re1ative mRNA contents of p27kip1［（46.5±7.9）vs（100.0±13.8）］，p57kip2［（41.3±5.8）vs（100.0±14.2）］，Fas［（35.9±6.8）vs（100.0±12.7）］，FasL［（44.1±5.5）vs（100.0±14.1）］，ActD［（26.8±3.6）vs（100.0±16.7）］，Caspase-3［（38.1±5.8）vs（100.0± 15.5）］，Caspase-8［（24.2±4.5）vs（100.0±11.9）］，Caspase-9［（56.1±7.9）vs（100.0±14.6）］in cervica1 tissues of the patho1ogica1 group were significant1y 1ower than those in the contro1 group and negative1y corre1ated with re1ative contents of NBS1 mRNA（r=-0.614，-0.705，-0.662，-0.592，-0.783，a11 P＜0.05）.Conclusion The expression of NBS1 in cervica1 squamous ce11 carcinoma abnorma11y increases，which is re1ated to the changes of pro1iferation and apoptosis re1ated genes.

Cervica1 squamous ce11 carcinoma；NBS1；Pro1iferation；Apoptosis

R737.33

A

1673-7210（2016）07（c）-0038-04

2016-04-05本文编辑：任念）

广东省公益研究与能力建设专项资金资助项目（2014A020212731）。

▲通讯作者